目前，大部分的細(xì)胞檢測(cè)方法采用的仍然是傳統(tǒng)的終點(diǎn)法——僅僅給出最終結(jié)果，而且往往需要標(biāo)記細(xì)胞和破壞細(xì)胞。這種方法無(wú)法得到細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)的真正狀態(tài)，也無(wú)法對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程做出動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)和分析。美國(guó)Essen公司開發(fā)了第二代長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像分析儀——IncuCyte Zoom，用一種非侵入式的方法，記錄細(xì)胞的實(shí)時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)。這種成像方法，被稱為“實(shí)時(shí)細(xì)胞內(nèi)涵成像”（Live Content Imaging），擴(kuò)充了用戶記錄和理解細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞行為和細(xì)胞形態(tài)的途徑。
IncuCyte Zoom是一套用于非傷害的、長(zhǎng)時(shí)間實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的活細(xì)胞成像分析平臺(tái)。IncuCyte分為信號(hào)采集機(jī)和控制機(jī)兩部分，信號(hào)采集機(jī)可放置于培養(yǎng)箱中，中間放置多種規(guī)格尺寸的板、皿、瓶及載玻片，在其下方有顯微照相設(shè)備，通過顯微拍照，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)測(cè)，并通過聯(lián)網(wǎng)的電腦進(jìn)行遠(yuǎn)程控制、數(shù)據(jù)讀取與分析。系統(tǒng)可自動(dòng)收集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的相差圖像和紅/綠熒光圖像。用戶除了可以得到各種格式的圖像或動(dòng)態(tài)錄像外，還可以得到由系統(tǒng)軟件自動(dòng)依據(jù)飽和度和計(jì)數(shù)分析生成的基于圖像應(yīng)用的圖表，以顯示細(xì)胞的變化及趨勢(shì)。
IncuCyte的優(yōu)勢(shì)：1）培養(yǎng)的細(xì)胞用高清晰度相差顯微鏡或熒光顯微鏡直接監(jiān)測(cè)，為非破壞性的監(jiān)測(cè)，細(xì)胞不用染色便可以觀察監(jiān)測(cè)，影像效果好；2）監(jiān)測(cè)過程中細(xì)胞無(wú)需離開培養(yǎng)箱，不用擔(dān)心培養(yǎng)條件的改變對(duì)細(xì)胞的影響；3）真正的長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像，可達(dá)數(shù)天或數(shù)月，高清晰度相差成像能消除微孔板的彎液面缺陷（meniscus artifacts），且沒有傳統(tǒng)顯微系統(tǒng)的光暈問題，可以在384微孔板內(nèi)監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)；4）圖像處理軟件自動(dòng)依據(jù)飽和度和計(jì)數(shù)分析，量化細(xì)胞增殖；5）自動(dòng)輸出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞生長(zhǎng)錄像；6）實(shí)時(shí)監(jiān)控，可改變傳統(tǒng)的“終點(diǎn)法”實(shí)驗(yàn)方法，數(shù)據(jù)豐富，更準(zhǔn)確、更靈活；7）高通量，可同時(shí)監(jiān)測(cè)6塊標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板/皿/瓶/載玻片，包括96-孔微孔板和384-孔微孔板，細(xì)胞在384-孔微孔板內(nèi)實(shí)驗(yàn)，可以減少寶貴的藥品消耗；8）支持超過200種的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)容器，無(wú)需特殊的培養(yǎng)容器，節(jié)約后期實(shí)驗(yàn)成本；9）可遠(yuǎn)程監(jiān)控，進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析，無(wú)需反復(fù)出入細(xì)胞房，避免了潛在的污染隱患及人工出入觀測(cè)之麻煩。
圖１：培養(yǎng)箱中的IncuCyte Zoom
與第一代成像儀IncuCyte FLR相比，IncuCyte Zoom是全新設(shè)計(jì)的，增加了很多關(guān)鍵的性能，包括支持多通道熒光成像，支持多物鏡選擇，增加了形態(tài)處理的能力和達(dá)到更高的速度。新增的特性有：1）IncuCyte Zoom可支持高清晰度（HD）相差、黃綠熒光和紅色熒光自動(dòng)成像功能，圖像處理軟件支持對(duì)三通道成像的整合處理；2）用戶可在1分鐘之內(nèi)自行更換4×、10×和20×物鏡，而無(wú)須專業(yè)人員的幫助；3）因?yàn)閾碛?2個(gè)全核處理器和新的軟硬件，其成像速度達(dá)到了第一代FLR的兩倍；4）采用了新的相機(jī)設(shè)計(jì)，使其更適合長(zhǎng)時(shí)間觀察；5）設(shè)計(jì)了新的數(shù)據(jù)庫(kù)，使用戶能更方便的查找和檢索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；6）增加了數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)量，配備了9TB的存儲(chǔ)空間，并支持外部數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)；7）提高了空氣流速，改善了散熱性能，增加了掃描時(shí)間；8）增加了系統(tǒng)監(jiān)控，整合了濕度傳感器、加速計(jì)來監(jiān)測(cè)不可接受的震動(dòng)、風(fēng)扇速度和內(nèi)部溫度；9）用戶可用位于控制機(jī)前部的LCD控制面板方便地檢測(cè)和運(yùn)行基礎(chǔ)狀態(tài)檢查和操作。
圖２：IncuCyte內(nèi)部結(jié)構(gòu)，支持超過200種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)容器，可同時(shí)觀察多達(dá)6塊培養(yǎng)容器
圖３：IncuCyte記錄的細(xì)胞的相差圖像和增殖曲線
圖３是IncuCyte記錄的細(xì)胞增殖的相差圖像和增殖曲線。左側(cè)圖像是在同一視野內(nèi)間隔12小時(shí)拍攝的CHO細(xì)胞的相差圖像，圖像可以24小時(shí)連續(xù)生成，而無(wú)需將細(xì)胞移出培養(yǎng)箱。右側(cè)的增殖曲線是依據(jù)間隔3小時(shí)的圖像生成的，由軟件自動(dòng)將圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成定量的飽和度vs.時(shí)間的數(shù)據(jù)，生成動(dòng)態(tài)的增殖曲線。最后圖像會(huì)被導(dǎo)出成單獨(dú)的JPEG文件或視頻。
IncuCyte軟件功能：用戶可以在任何一臺(tái)聯(lián)網(wǎng)的計(jì)算機(jī)上操控儀器，而無(wú)需反復(fù)拿進(jìn)拿出標(biāo)本及出入細(xì)胞房，這使IncuCyte成為了一個(gè)“虛擬的培養(yǎng)箱”。IncuCyte最好的特點(diǎn)之一就是直覺式的軟件界面設(shè)計(jì)。用戶可以在軟件的操作界面上定義耗材的類型、拍攝的時(shí)間、位置及視野個(gè)數(shù)。支持在長(zhǎng)時(shí)間拍攝過程中插入其他拍攝任務(wù)繼續(xù)進(jìn)行拍攝，以充分利用儀器。IncuCyte可以自動(dòng)對(duì)焦，自動(dòng)進(jìn)行圖像收集。對(duì)得到的圖像也可以進(jìn)行亮度、尺寸、對(duì)比度的顯示控制。用戶可以自定義樣本信息，進(jìn)行分組分析，并可以電子化標(biāo)記器皿，設(shè)定關(guān)鍵詞，必要時(shí)可用設(shè)定的關(guān)鍵詞搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，方便查詢過去任何時(shí)間得到的圖像和數(shù)據(jù)。用戶還可以直接從軟件中抓取圖像、圖表、曲線至Word、Excel、Powerpoint和Email中。生成的所有數(shù)據(jù)均可存檔，并且數(shù)據(jù)和圖表可以打包封存，便于用戶帶回家分析。IncuCyte Zoom的新特性包括多熒光圖像處理模塊和新的相差成像處理模塊。Zoom還設(shè)計(jì)了新的數(shù)據(jù)庫(kù)，使用戶能更容易查找和檢索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
圖４：軟件操作界面
IncuCyte的應(yīng)用：
（一） 監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖（Proliferation）
可監(jiān)測(cè)細(xì)胞的飽和度，或用熒光標(biāo)定細(xì)胞核，計(jì)算細(xì)胞核的個(gè)數(shù)。
關(guān)鍵特性：1）IncuCyte Zoom結(jié)合NucLight Red和NucLight Green試劑，直接監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖；2）在4×、10×或20×物鏡條件下對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)；3）每個(gè)時(shí)間點(diǎn)可提供576個(gè)（96孔板）和2304個(gè)（384孔板）孔的數(shù)據(jù)；4）自動(dòng)進(jìn)行圖像獲取和處理；5）可計(jì)算基于細(xì)胞核計(jì)數(shù)的倍增時(shí)間，而無(wú)須lift細(xì)胞；6）可得到生長(zhǎng)因子對(duì)原生細(xì)胞（primary cells）和長(zhǎng)生細(xì)胞（immortalized cells）增殖的影響；7）細(xì)胞不離開培養(yǎng)箱，所有數(shù)據(jù)均有圖像和影片驗(yàn)證。
圖5：轉(zhuǎn)染NucLight Red lentivirus試劑的HT-1080細(xì)胞用不同濃度的放線菌酮（Cycloheximide，CHX）處理，在4×條件下用Zoom每3小時(shí)拍攝一次。雖然沒有觀察到細(xì)胞形態(tài)的變化，但觀察到基于濃度的細(xì)胞增殖的抑制。曲線下面積（AUC）值被用于計(jì)算化合物的IC50值。倍增時(shí)間通過計(jì)算指數(shù)生長(zhǎng)公式得到。下方的圖像為48hr時(shí)的熒光圖像。
圖6：HUVEC細(xì)胞用NucLight Red lentivirus試劑轉(zhuǎn)染，血清饑餓2hr后用含1%FBS和不同濃度bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)（左圖），或bFGF保持在10ng/ml，而Suramin的濃度不斷增大（右圖）。用Zoom每3hr拍攝一次，左圖用4×物鏡拍攝，而右圖用10×物鏡拍攝。整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中都進(jìn)行了細(xì)胞核計(jì)數(shù)，并通過計(jì)算曲線下面積（AUC）獲得EC50和IC50值。
（二）細(xì)胞質(zhì)控（Cell Culture QC）/細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化（Cell Culture Optimization）
監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)上的變化，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)控，如進(jìn)行自動(dòng)化的細(xì)胞培養(yǎng)，用175T培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)出大量且高質(zhì)量的細(xì)胞，可做進(jìn)一步細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來源。監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)曲線與培養(yǎng)基的血清濃度的變化，尋找最適合的培養(yǎng)基的血清濃度。監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)曲線與培養(yǎng)基的配方的變化，尋找最適合的培養(yǎng)基配方。
關(guān)鍵特性：1）對(duì)高清晰相差成像進(jìn)行用戶定義的相分割；2）可收集到4×、10×或20×的圖像；3）非標(biāo)記的相分割指標(biāo)利用細(xì)胞飽和度跟蹤細(xì)胞隨時(shí)間的生長(zhǎng)狀況；4）能夠檢測(cè)促血管生成（pro-angiogenic）和抗血管生成（anti-angiogenic）的反應(yīng)；5）可對(duì)克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)和大小觀察；6）可通過對(duì)培養(yǎng)瓶不同部位的成像，優(yōu)化細(xì)胞的分布；7）可對(duì)圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行存檔，以便在未來對(duì)生長(zhǎng)特性進(jìn)行回顧確認(rèn)；8）根據(jù)細(xì)胞飽和度，優(yōu)化原生細(xì)胞和長(zhǎng)生細(xì)胞的生長(zhǎng)條件；9）可決定最佳接種密度；10）可分析微孔板布局，促進(jìn)移液技術(shù)。
圖7：HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)在包含生長(zhǎng)因子和不同濃度胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中，HUVEC的最佳FBS濃度是＞2.5%。
圖8：對(duì)不同接種密度的HT-1080細(xì)胞每3小時(shí)拍攝一次，一共拍攝3天，得到實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的飽和度vs.時(shí)間的圖像。
（三） 監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性（Cytotoxicity）
細(xì)胞毒性發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)破裂，這時(shí)使用非滲透的染料YOYO-1就可以將發(fā)生細(xì)胞毒性的細(xì)胞染色，然后用IncuCyte進(jìn)行觀察。
關(guān)鍵特性：1）運(yùn)用NucLight試劑，并結(jié)合細(xì)胞非滲透性DNA染料；2）可區(qū)別細(xì)胞毒性（Cytotoxic）和細(xì)胞抑制（Cytostatic）；3）可從雙色分析儀中輸出數(shù)據(jù)，計(jì)算EC50和IC50；4）可通過獲取4×、10×或20×的高清晰度相差圖像，跟蹤細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)細(xì)胞是否死亡；5）可保存和重新使用過程定義，為未來的實(shí)驗(yàn)分析YOYO-1和NucLight-Red數(shù)據(jù)。
圖9： HT-1080細(xì)胞用NucLight-Red標(biāo)記，并在YOYO-1存在的條件下用喜樹堿（Camptothecin）處理。高清晰度相差圖像和熒光圖像用于確認(rèn)細(xì)胞是否死亡。
圖10：用基礎(chǔ)分析儀（Basic Analyzer）計(jì)算紅色細(xì)胞核的個(gè)數(shù)和YOYO-1標(biāo)記的細(xì)胞隨時(shí)間的變化。數(shù)據(jù)輸出后，曲線下面積（AUC）被用來計(jì)算喜樹堿（Camptothecin）對(duì)HT-1080細(xì)胞作用的IC50值和EC50值。
圖11：喜樹堿（Camptothecin）（上圖）和Cycloheximide（放線菌酮）（下圖）引起的HT-1080細(xì)胞的毒性（Cytotoxic Effects）和抑制作用（Cytotostatic Effects）。左圖表示用YOYO-1動(dòng)態(tài)顯示的細(xì)胞的死亡，右圖表示用NucLight Red顯示的細(xì)胞的增殖。
（四） 監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡（Apoptosis）
CellPlayer細(xì)胞凋亡試劑盒中的凋亡試劑是DNA染料和Caspase3/7酶的底物的連接物。如果細(xì)胞發(fā)生Caspase3/7途徑的凋亡，當(dāng)將此試劑加入培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞膜上的活化的Caspase 3/7酶就會(huì)降解此連接物，使原來不發(fā)光的染料從連接物中脫離下來，與細(xì)胞的DNA雙鏈結(jié)合，從而發(fā)出黃綠熒光，被IncuCyte檢測(cè)到。這樣就可以用IncuCyte觀察細(xì)胞的凋亡全過程。
關(guān)鍵特性：1）用NucLight試劑標(biāo)記細(xì)胞來檢測(cè)細(xì)胞的增殖，并動(dòng)態(tài)監(jiān)控化合物的細(xì)胞抑制（抗增殖）作用；2）直接向細(xì)胞中加入Caspase 3/7試劑，而無(wú)需額外的洗滌步驟，可檢測(cè)由內(nèi)在或外在途徑引起的細(xì)胞凋亡；3）可從雙色分析儀中輸出數(shù)據(jù)，計(jì)算IC50和EC50。4）用4×、10×或20×物鏡觀察高清晰度相差圖像，以確定細(xì)胞的死亡；5）定量的可重復(fù)性：可保存并重新使用過程定義，方便未來實(shí)驗(yàn)時(shí)分析Caspase 3/7和NucLight Red數(shù)據(jù)；可進(jìn)行96孔和384孔形式的實(shí)驗(yàn)；每次可觀察6塊微孔板。
內(nèi)在通路（Intrinsic Pathway）引起的細(xì)胞凋亡：
圖12：表現(xiàn)為紅色細(xì)胞核的宮頸腺癌細(xì)胞在有Caspase 3/7試劑的條件下用不同濃度的十字孢堿（Staurosporine，SSP）處理。過程定義可以準(zhǔn)確計(jì)量紅色細(xì)胞核對(duì)象個(gè)數(shù)和綠色Caspase 3/7對(duì)象個(gè)數(shù)。
圖13：通過基礎(chǔ)分析儀輸出Caspase對(duì)象個(gè)數(shù)/mm2和細(xì)胞核對(duì)象個(gè)數(shù)/mm2，并利用曲線下面積（AUC）計(jì)算出EC50和IC50。
圖14：用基礎(chǔ)分析儀，可檢測(cè)隨時(shí)間改變的Caspase 3/7活性（左圖）和細(xì)胞核個(gè)數(shù)（右圖）。
圖15：外在通路引起的細(xì)胞凋亡。在5μg/ml放線菌酮（Cycloheximide）存在的條件下用不同濃度的腫瘤壞死因子α（TNF-α）處理A549肺上皮細(xì)胞（Lung Epithelial Cells），用基礎(chǔ)分析儀定量計(jì)算Caspase 3/7的活性。
（五） 監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移（Cell Migration）/監(jiān)測(cè)細(xì)胞侵襲（Cell Invasion）
IncuCyte的Migration模組中有96孔的傷口劃痕器（Wound Maker），可以在96孔微孔板上生成96個(gè)均勻一致的傷口，然后用IncuCyte記錄傷口愈合（Wound Healing）的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)全過程。
IncuCyte可以從預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)來獲得圖像并轉(zhuǎn)換成影片。系統(tǒng)記錄了初始的Wound Mask，然后隨著Revised Wound Mask的生成，系統(tǒng)持續(xù)記錄圖像來跟蹤傷口的愈合。IncuCyte還可用于其它細(xì)胞運(yùn)動(dòng)如“遷移”和“侵襲”的監(jiān)測(cè)。用戶可以很直觀地通過2D的遷移和3D的侵襲圖像來觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并對(duì)兩種細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方式進(jìn)行對(duì)比。在我們的高清成像基礎(chǔ)上，細(xì)胞無(wú)需標(biāo)記就可以進(jìn)行觀察。使用專利的算法，可以得到綜合的基于時(shí)間推移的持續(xù)性圖像采集指標(biāo)，包括：相對(duì)傷口密度（專利）、傷口飽和度、傷口寬度，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量性和重復(fù)性更好。所有時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)都可以通過細(xì)胞圖像和影片進(jìn)行驗(yàn)證。
細(xì)胞遷移/細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵特征：1）可在同一塊96孔微孔板中通過4×、10×或20×的物鏡測(cè)量2D的細(xì)胞遷移和3D的細(xì)胞侵襲；2）在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)可生成576個(gè)孔的數(shù)據(jù)（6×96）；3）可對(duì)原生細(xì)胞系和長(zhǎng)生細(xì)胞系進(jìn)行非標(biāo)記的細(xì)胞遷移/細(xì)胞侵襲定量測(cè)定；4）可自動(dòng)分析測(cè)量相對(duì)傷口密度、傷口飽和度和傷口寬度；5）可用圖像和時(shí)序錄像驗(yàn)證藥理學(xué)作用；6）可用Zoom的雙色熒光系統(tǒng)拍攝和研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲中的熒光細(xì)胞。
圖16：左圖是HT-1080細(xì)胞在8mg/ml Matrigel中的細(xì)胞侵襲圖像；右圖是MDA-MB-231細(xì)胞在6mg/ml Matrigel中的細(xì)胞侵襲圖像。
圖17：左圖是三種細(xì)胞系，HT-1080、MDA-MB-231和MCF-7的細(xì)胞遷移曲線；左圖是兩種細(xì)胞系，HT-1080和MDA-MB-231的細(xì)胞侵襲曲線，MCF-7細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞侵襲。
圖18：藥理學(xué)研究：顯示肌球蛋白抑制劑（blebbistatin）對(duì)HT-1080細(xì)胞在8mg/ml Matrigel中的細(xì)胞侵襲的濃度響應(yīng)。
（六）監(jiān)測(cè)血管新生（Angiogenesis）
血管新生是一種復(fù)雜、多步的過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成。IncuCyte的CellPlayer Angiogenesis PrimeKit將GFP標(biāo)記的人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（human vascular endothelial cells，HUVECs）和正常的人真皮成纖維細(xì)胞（normal human dermal fibroblast，NHDFs）共培養(yǎng)，共培養(yǎng)物就會(huì)有新生血管生成，然后用IncuCyte進(jìn)行觀察。IncuCyte Zoom和CellPlayer Angiogenesis PrimeKit合用，能監(jiān)測(cè)血管生成的全過程，同時(shí)測(cè)定藥物對(duì)血管生成的作用。
關(guān)鍵特性包括：1）使用人類的原生細(xì)胞和共培養(yǎng)體系顯示血管新生過程中的所有階段的變化；2）有活細(xì)胞和冷凍細(xì)胞試劑盒兩種選擇；3）Zoom和血管新生軟件相結(jié)合可自動(dòng)獲取時(shí)序性圖像，提供血管長(zhǎng)度、血管面積和分支節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)等動(dòng)態(tài)指標(biāo)；4）動(dòng)態(tài)讀數(shù)可研究復(fù)雜的通路，包括VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）和non-VEGF（非血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）信號(hào)介導(dǎo)的血管新生和血管分解；5）能測(cè)量促血管生成（pro-angiogenic）和抗血管生成（anti-angiogenic）的作用；6）所有數(shù)據(jù)均有圖像和影片進(jìn)行驗(yàn)證；7）可在96孔微孔板中反應(yīng)，數(shù)據(jù)定量并可重復(fù)。
Essen可提供CellPlayer血管新生原生冷凍試劑盒（CellPlayer Angiogenesis PrimeKit -Cryo）、CellPlayer血管新生原生新鮮試劑盒（CellPlayer Angiogenesis PrimeKit-Live），和血管新生實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。具體試劑盒規(guī)格和實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)可參考Essen網(wǎng)站。
圖19：血管新生，第1天和第14天對(duì)比，血管長(zhǎng)度從0.6mm/mm2增長(zhǎng)到11.6mm/mm2
圖20：不同濃度的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）對(duì)血管新生的動(dòng)態(tài)作用。
另一種試劑盒是CellPlayer Angiogenesis StemKit，它將用GFP標(biāo)記的內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞（endothelial colony-forming cells，EDFC）和脂肪組織來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSC）共培養(yǎng)，共培養(yǎng)物就會(huì)有新生血管生成，然后用IncuCyte進(jìn)行觀察。IncuCyte Zoom和CellPlayer Angiogenesis StemKit合用，能監(jiān)測(cè)血管生成的全過程，同時(shí)測(cè)定藥物對(duì)血管生成的作用。
關(guān)鍵特性包括：1）是人類來源的共培養(yǎng)干細(xì)胞模型；2）以冷凍試劑盒形式提供；3）比PrimeKit試劑盒的血管生成速度更快；4）外皮細(xì)胞生物學(xué)（Pericyte biology）；5）可對(duì)血管形成和血管分解進(jìn)行動(dòng)態(tài)讀?。?）所有指標(biāo)均有圖像和錄像進(jìn)行驗(yàn)證；7）可在96孔微孔板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)性好（Z’＞0.8）。
Essen可提供冷凍形式的CellPlayer血管新生干細(xì)胞試劑盒（CellPlayer Angiogenesis StemKit）和血管新生實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)。具體試劑盒規(guī)格和實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)可參考Essen網(wǎng)站。
圖21：將促血管新生蛋白因子（angiopoietin 2，Ang-2）加入已形成的血管網(wǎng)絡(luò)中，動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)顯示血管發(fā)生分解。
（七） 監(jiān)測(cè)報(bào)告基因（Reporter Gene）
細(xì)胞用含GFP的載體轉(zhuǎn)染，GFP的上游插入需要研究的啟動(dòng)子。這樣就可以通過IncuCyte觀察GFP的熒光強(qiáng)度和發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)目，從而監(jiān)測(cè)啟動(dòng)子的活性或報(bào)告基因的表達(dá)活性。
與傳統(tǒng)的終點(diǎn)熒光素酶方法對(duì)比，IncuCyte的關(guān)鍵特征在于：1）數(shù)據(jù)豐富：96孔的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)可獲得終點(diǎn)法無(wú)法獲得的洞察能力；2）節(jié)約成本：無(wú)需裂解，無(wú)需熒光素酶法需要的終端反應(yīng)底物，節(jié)省時(shí)間和花費(fèi)；3）方便：實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)讀數(shù)使用戶能在單個(gè)的實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化信號(hào)窗，無(wú)需事先決定何時(shí)終止實(shí)驗(yàn)；4）敏感：可得到每個(gè)條件下的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)，增加了實(shí)驗(yàn)的定量性和穩(wěn)定性（quantitative robustness）；5）可定制：用戶可根據(jù)需要定制啟動(dòng)子，修改反應(yīng)體系，監(jiān)測(cè)藥物對(duì)報(bào)告基因的作用。
Essen可按照客戶需要提供此實(shí)驗(yàn)的外包服務(wù)，具體外包服務(wù)內(nèi)容請(qǐng)參考Essen網(wǎng)站。
圖22：rhTNF-α刺激誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞中，rhGFP報(bào)告基因表達(dá)的NF-κB的活性。在用pNF-κB-rhGFP報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中，用3倍稀釋的rhTNF-α處理。圖像以15min為間隔獲得。對(duì)象飽和度（Object Confluence）表示報(bào)告基因的表達(dá)和/或啟動(dòng)子的活性。
（八）細(xì)胞分化研究（Cell Differentiation）：可在培養(yǎng)箱中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)分析。
IncuCyte Zoom的應(yīng)用總結(jié)：
1）監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖（Proliferation）：通過實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行非侵入性的、定量的分析；
2）細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)控（Cell Culture QC）/細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化（Cell Culture Optimization）：通過實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像，可生成基于細(xì)胞飽和度的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)曲線；
3）監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性（Cytotoxicity）：將染料和細(xì)胞混合然后讀數(shù)，操作者可離開，是基于染料的實(shí)驗(yàn)；
4）監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡（Apoptosis）：將凋亡試劑和細(xì)胞混合然后讀數(shù)，操作者可離開，是基于染料的實(shí)驗(yàn)；
5）監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移（Cell Migration）/細(xì)胞侵襲（Cell Invasion）：配套高度一致性的96孔傷口劃痕工具，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)傷口的愈合過程，可得到細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的定量指標(biāo)；
6）監(jiān)測(cè)血管新生（Angiogenesis）：使用通過驗(yàn)證的血管新生試劑盒，具有動(dòng)態(tài)分析血管新生的定量指標(biāo)；
7）監(jiān)測(cè)報(bào)告基因（Reporter Gene）：細(xì)胞無(wú)需裂解，可獲得實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)；
8）細(xì)胞分化研究（Cell Differentiation）：在培養(yǎng)箱中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)分析等。
總結(jié)：
以上一些關(guān)鍵的重要的應(yīng)用介紹，展示了IncuCyte Zoom 系統(tǒng)在定量的、非入侵性的、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析上的作用。非標(biāo)記、非損傷性的成像技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析可以讓用戶獲得高質(zhì)量的圖像、錄像和數(shù)據(jù)。與其他利用電子阻抗監(jiān)測(cè)細(xì)胞不同，IncuCyte可以記錄細(xì)胞形態(tài)，得到圖像和動(dòng)態(tài)的錄像。另外，Essen還開發(fā)出更多的活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察試劑盒（live cell kinetic assays and reagents），與Zoom配套使用，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)開發(fā)（assay development）、技術(shù)評(píng)估（technology assessment）、外包服務(wù)（fee-for-service outsourcing）和藥物開發(fā)合作（drug discovery partnerships）。
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