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由CompuCyte開發(fā)的新的細(xì)胞分析儀-激光掃描細(xì)胞儀(Laser Scanning Cytometer, LSC)，以多組參數(shù)分析細(xì)胞及形態(tài)，是當(dāng)今世界上***先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器,在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等領(lǐng)域已成為新***代強(qiáng)有力的研究工具,受到了生物醫(yī)學(xué)界的極大關(guān)注, 已成為***內(nèi)外的***個注目點。 

定量細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)及組織掃描

多時段同點分析

適應(yīng)多種樣本類型，包括：

組織

 粘附細(xì)胞

具有完整的顯微鏡功能 

流式細(xì)胞儀已在全世界廣泛應(yīng)用。然而，仍有許多任務(wù)流式細(xì)胞無法完成，比如檢測細(xì)胞粘附、相隔時間重復(fù)檢測同***細(xì)胞和在細(xì)胞上或胞內(nèi)定位探針染色位置。流式細(xì)胞儀很難檢測只含有數(shù)百個細(xì)胞的樣本，而此問題在檢測只含有數(shù)百個細(xì)胞的多達(dá)1536個微孔時更加復(fù)雜了。***些儀器如共聚焦顯微鏡和微板掃描圖像系統(tǒng)可作高分辨分析及提供其他分析功能，但只能提供低通量分析并要求操作者經(jīng)驗豐富。激光掃描細(xì)胞儀,它可以進(jìn)行低分辨分析，像流式細(xì)胞儀***樣對散射光和熒光進(jìn)行多參數(shù)檢測，從而提供高通量的分析。 

LSC應(yīng)用：

關(guān)鍵應(yīng)用示例

任何基于細(xì)胞學(xué)的研究

任何組織切片的研究 

細(xì)胞周期和DNA含量分析: 抗原表達(dá), 免疫分型 

多元化分析：

凋亡

遷移

細(xì)胞活性

膜電位 

細(xì)胞周期信息由生物化學(xué)及形態(tài)學(xué)信息構(gòu)成。

細(xì)胞周期可通過直接檢測DNA的含量來獲知。 

對生物學(xué)樣本的多色分析: 因LSC具備了高通量的能力，在生物學(xué)單細(xì)胞分析領(lǐng)域和細(xì)胞分析學(xué)中已變得越來越重要。結(jié)合不同的技術(shù)與染色方法，可對任何***個單細(xì)胞的多色分析。對于細(xì)胞分析來說，玻片式細(xì)胞儀（SBC）是實現(xiàn)這種技術(shù)的理想工作，它不像流式細(xì)胞儀，它沒有任何損耗，如樣本是被固定的載玻片上的并能夠重復(fù)進(jìn)行染色并檢測。方法和結(jié)果：我們在激光掃描細(xì)胞儀上（Laser Scanning Cytometer）進(jìn)行了多種多色熒光分析實驗。其中包括了不同的實驗過程，（1）多色細(xì)胞分相反，對***份樣本使用八種或更多熒光素進(jìn)行染色；（2）重復(fù)染色，使用同***熒光標(biāo)記的不同抗體進(jìn)行染色后逐***分析；（3）熒光淬滅，根據(jù)熒光的不同淬滅特征進(jìn)行不同的淬滅實驗；（4）熒光激活，激活不同的熒光顆?；蛉玖?；（5）光化裂解（裂解FRET染料）。通過LSC的重定位功能，可以以1um的精度對樣本中的同***細(xì)胞重復(fù)定位，從而經(jīng)過不同處理的樣本可再次進(jìn)行分析。結(jié)論：給合各種方法與技術(shù)，可在單細(xì)胞水平上進(jìn)行多色熒光分析。 

同時分析多個樣本中細(xì)胞對于培養(yǎng)物的反應(yīng)在生物實驗及化療效果評估中有重要作用。在此我們使用LSC來對多孔藥物誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行分析檢測。材料：使用2-MNOH或其他常用的化學(xué)藥物來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們分析了96孔中經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：我們證實LSC是***種在單細(xì)胞水平同時比較分析不同孔內(nèi)細(xì)胞在不同時間及藥物濃度情況下的變化。結(jié)論：這些數(shù)據(jù)有力說明了LSC適合于在單細(xì)胞水平同時、多參數(shù)分析不同細(xì)胞群體對藥物的反應(yīng)。

LSC，尺寸大約與研究級臺式流式細(xì)胞儀相同大小，是當(dāng)前制作最為精細(xì)的激光掃描細(xì)胞儀，可檢測由標(biāo)準(zhǔn)488nm氬離子激光器激發(fā)的綠色(530-nm), 橙色 (580-nm),和紅色 (610-nm) 熒光；由488nm或633nm氦氖激光器激發(fā)的遠(yuǎn)紅(670-nm) 和近紫外 (750-nm)熒光。藍(lán)色熒光素(460nm)可由400nm紫羅蘭半導(dǎo)體激光器激發(fā)，綠色氦氖激光器(543-nm)也可選配。

LSC儀器檢測為高分辨放大模式，一個典型的細(xì)胞圖像包含有上百個像素。

在LSC上，激光聚焦光束（通常為空冷488nm氬離子激光或633nm氦氖激光）通過檢流計驅(qū)動的一組透鏡來獲得光束的直徑，然后經(jīng)過顯微鏡的長通濾片，從而在標(biāo)本上形成2.5至10nm直徑的光束。

檢流計是由一個“鋸齒”信號來控制，它的振幅隨時間呈線性增長隨后又快速恢復(fù)初始值。當(dāng)在線性信號部分時，激光聚焦光束在標(biāo)本平面上呈線性移動。此線性移動的長度在171和685um之間，由物鏡的放大率決定。激光束方向的熒光信號由顯微鏡的物鏡收集，隨后通過二向色濾片，然后經(jīng)過不同帶寬的濾光片分離進(jìn)入其各的光電倍增管。光電倍增管信號以規(guī)律性的間距數(shù)字化，從而形成一組數(shù)據(jù)與0.5um掃描間距相一致的像素。在每一掃描線末端，顯微鏡的載物平臺與掃描垂直的方向移動0.5um，然后整個過程重復(fù)進(jìn)行。如此，儀器便可生成矩形掃描區(qū)域內(nèi)一個或多個熒光的數(shù)字影像。LSC還集成了一個前向散射光信號，使用顯微鏡鏡臺下冷凝器來收集光信號，然后由一個光敏二極管來檢測光散射信號，與流式細(xì)胞儀類似，前向方向也有一擋且擋穿透的激光。大角度散射光在實驗機(jī)上可檢測，但在現(xiàn)有的商品機(jī)中還不可用。

在流式細(xì)胞儀中，探測器或前置放大器輸出的是***組脈沖信號，細(xì)胞在隨意的時間里經(jīng)過檢測點形成了信號之間隨意間隔；細(xì)胞的光散射信號和熒光信號可由脈沖信號的高度和面積或?qū)挾葋肀硎?。在大多?shù)儀器中，收集的信號被轉(zhuǎn)化并存儲為脈沖信號，擁有高度、面積和寬度值，然后由電子計算機(jī)轉(zhuǎn)化這些信號作進(jìn)***步分析。信號隨著不規(guī)則的間隔（由細(xì)胞檢測的隨機(jī)時間決定）而被數(shù)字化并記錄下來。
在激光掃描細(xì)胞儀中，探測器或前置放大器所輸出的信號是***個對樣本***定區(qū)域的光柵掃描信號，并以衡定的間隔被數(shù)字化，所產(chǎn)生的是數(shù)字矩陣信號，其中包括了***幅圖片的***個原素或像素。有關(guān)***個細(xì)胞的數(shù)據(jù)以***個數(shù)量***的連續(xù)像素來表示；這個數(shù)量***在低分辨系統(tǒng)時可能是10，而在高分辨系統(tǒng)中會達(dá)到100。然而，盡管激光掃描細(xì)胞儀的圖像有效像素會小至與高分辨數(shù)字顯微鏡***樣（0.5um），但它的空間分辨率會低些，因為激光的聚焦光束大于***個像素的空間。

激光光束特性

激光作為細(xì)胞儀的光源是因為它所輸出的激光能被聚焦成為很小斑點。然而，根據(jù)激光基礎(chǔ)物理學(xué)，聚焦光斑越小，在光束聚焦后的光路上發(fā)生的散射越快。這個現(xiàn)象在共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡中都會發(fā)生，而它們典型的光斑< 1um，聚焦深度不到***個微米，并且聚焦光斑在每個檢測點上會快速上下移動。這樣便可在薄的標(biāo)本切片上獲得高分辨率熒光圖像或三維結(jié)構(gòu)圖。典型的流式細(xì)胞儀聚集光斑的尺寸50-120um寬—形成***個比樣本流寬的穩(wěn)定的光束；光斑的高度為5-50nm；更窄的聚焦光束可得到更為詳細(xì)的有關(guān)細(xì)胞尺寸的信息，但因光線的發(fā)散，會使在極小角度收集散射光的步驟復(fù)雜化。激光光斑寬度和高度的臨界尺寸在幾百微米左右。當(dāng)光束高度比細(xì)胞小時，流式細(xì)胞儀的空間分辨率好；當(dāng)光束增大趕到比細(xì)胞大幾倍時，分辨率降低直至無信號出現(xiàn)。

在激光掃描細(xì)胞儀中，聚焦光斑，或腰部（***細(xì)處，典型的為2.5-10um）界于流式細(xì)胞儀和共焦之間。聚焦的深度為100um，可在載玻片或毛細(xì)管中形成并收集統(tǒng)***的信號。盡管圖像的像素之間有間隔（0.5-4um），但視覺的分辨率卻不高，因為聚焦光斑（2.5-10um）比像素本身要大。