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熱點(diǎn)應(yīng)用丨DNA熒光信標(biāo)探針檢測

2024-01-11 09:59:19

分子信標(biāo)探針是核苷酸序列（DNA 和 RNA 的組成部分），用于熒光檢測特定 DNA 或 RNA 序列的存在。分子信標(biāo)（圖 1）的設(shè)計(jì)使得序列末端的少量核苷酸堿基（5 到 7 個）彼此互補(bǔ)并配對形成所謂的莖。莖的形成產(chǎn)生了***個未配對堿基的環(huán)，稱為莖環(huán)或發(fā)夾環(huán)。***后，在核苷酸序列的***端有***個共價連接的熒光團(tuán)，而在序列的另***端有***個熒光猝滅劑。當(dāng)分子信標(biāo)處于這種發(fā)夾形式時，猝滅劑通過 F?rster 共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 猝滅極大地減少了熒光團(tuán)的熒光。

圖1：分子信標(biāo)探針

與分子信標(biāo)具有互補(bǔ)堿基的核苷酸序列稱為互補(bǔ) DNA (cDNA)。在cDNA 存在的情況下，分子信標(biāo)發(fā)夾將打開并與 cDNA 雜交形成雙鏈序列（圖 2）。這種雜交導(dǎo)致猝滅劑和熒光團(tuán)進(jìn)***步分開，從而熒光團(tuán)發(fā)射不再被猝滅。通過監(jiān)測來自熒光團(tuán)的熒光變化，可以識別和量化 cDNA 的存在。

圖2：分子信標(biāo)和cDNA之間的反應(yīng)，其中a）是cDNA，b）分子信標(biāo)，c）雜交雙鏈序列。

分子信標(biāo)探針可以定制設(shè)計(jì)以靶向特定的 DNA 或 RNA 序列，從而允許分子信標(biāo)用于 DNA 和 RNA 的實(shí)時檢測和定量。主要用于PCR 定量、體內(nèi) RNA 檢測、病原體檢測、病毒載量定量和研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用。分子信標(biāo)的使用，加上靈敏的熒光光譜儀和樣品溫度控制，有助于測量極低濃度的 DNA 或 RNA。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置

分子信標(biāo)探針及cDNA 購自于默克公司。所有數(shù)據(jù)均從配有 SC-27 （4位溫度控制樣品模塊） Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計(jì)獲得。SC-27 用于在單獨(dú)攪拌的同時加熱四種具有不同濃度 cDNA 和分子信標(biāo)的溶液。配置100 nM 的分子信標(biāo)以及0 nM、20 nM、40 nM 和 60 nM cDNA 溶液。

圖3：FS5熒光光譜儀與SC-27樣品架

發(fā)夾開口的溫度依賴性

cDNA和分子信標(biāo)之間的雜交可以在信標(biāo)處于閉合發(fā)夾形式時發(fā)生，但會緩慢進(jìn)行?？梢酝ㄟ^加熱分子信標(biāo)以打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)來加速雜交。當(dāng)加熱時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖堿基對之間的吸引力被克服，這被稱為變性，并且發(fā)夾打開?？梢允褂脺囟纫蕾囆詿晒庋芯看碎_口的溫度依賴性（圖 4）。

圖4：不同溫度下的分子信標(biāo)熒光強(qiáng)度

使用溫控樣品模塊時，F(xiàn)S5 Fluoracle ?軟件可以自動獲取溫度圖。熒光溫度圖（圖 4）是通過在每個溫度下加熱樣品 20 分鐘同時攪拌以確保樣品均勻加熱而獲得的，20 分鐘后，在移動到下***個溫度之前測量發(fā)射光譜?？梢钥闯?，由于發(fā)夾開口和 FRET 猝滅的減少，熒光強(qiáng)度隨溫度增加而增加。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn) 60°C 是發(fā)夾完全打開的適當(dāng)溫度，60°C 時的熒光強(qiáng)度是 20°C 時的 50 倍?；谶@些結(jié)果，選擇 60°C 作為 DNA 檢測的孵育溫度。

DNA檢測

將具有不同 cDNA 濃度的分子信標(biāo)的四種溶液移至比色皿中并放置在 SC-27 的四個位置。為了促進(jìn) cDNA 和信標(biāo)序列的雜交，將溶液通過在 60°C 加熱并在該溫度下保持 20 分鐘進(jìn)行溫育。然后冷卻回 20°C 并在該溫度下再保持 20 分鐘。這種加熱和冷卻的孵化過程增加了分子信標(biāo)和 cDNA 之間的雜交率，如圖 5 所示。

圖5：SC-27中的cDNA和分子信標(biāo)雜交孵化程序示意圖。

孵育后四種溶液的熒光光譜依次進(jìn)行測量，如圖 6 所示。SC-27 可以自動測量具有相同測量參數(shù)的四種樣品?？梢钥闯?，即使沒有任何 cDNA 存在，僅分子信標(biāo)溶液也顯示出其特征發(fā)射，這是由于少量熒光團(tuán)在溶液中游離。隨著 cDNA 濃度的增加，由于信標(biāo)與 cDNA 雜交并且信標(biāo)上的熒光團(tuán)未淬滅，因此熒光強(qiáng)度增加。

圖6：在不同濃度的cDNA存在下，分子信標(biāo)溶液的熒光光譜

已知 cDNA 濃度的樣品的熒光強(qiáng)度可以建立熒光強(qiáng)度和 cDNA 之間的數(shù)學(xué)相關(guān)性。使用 Fluoracle ?的定量分析功能，圖 6 中的測量值用于創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線，將 516 nm 峰的發(fā)射強(qiáng)度與 cDNA 濃度相關(guān)聯(lián)（圖 7）。

圖7：cDNA濃度趨勢分析

發(fā)現(xiàn) cDNA 濃度和熒光強(qiáng)度之間存在以下線性關(guān)系：

Y = 1.076 × 105 + 6.024 × 102 X

其中 Y 是 516nm 處的熒光強(qiáng)度，X 是 cDNA 濃度，單位為 nM。

根據(jù)這種數(shù)學(xué)相關(guān)性，未知樣品中 cDNA 的濃度可以通過其熒光強(qiáng)度確定。為了證明這***點(diǎn)，對具有 100 nM 分子信標(biāo)濃度和未知 cDNA 濃度的樣品進(jìn)行孵育，并測量 516 nm 處的熒光，其cDNA 濃度為 27 nM（圖 8）。

圖8：cDNA已知濃度樣品（橙色點(diǎn)）和未知cDNA濃度樣品（紅圈）的校準(zhǔn)曲線。

結(jié)  論

Edinburgh Instruments FS5 熒光分光光度計(jì)用于使用分子信標(biāo)探針以nM量***確定未知濃度的 DNA，與此同時，使用 SC-27 四位溫度控制樣品模塊孵育 DNA 和探針溶液，并自動測量四種溶液的熒光強(qiáng)度，***后使用 FS5 Fluoracle ?軟件的定量分析功能分析測試結(jié)果。

(文章來源于互聯(lián)網(wǎng))

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