摘 要

正 文

維生素在人體生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是人體必須的微量營(yíng)養(yǎng)素，缺乏或過(guò)量都會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響。維生素A、D、E是脂溶性維生素，研究表明缺乏這些維生素會(huì)增加患夜盲癥、骨質(zhì)疏松、心血管疾病及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1],嬰幼兒及未成年人缺乏其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響則更為明顯[2-4]。目前維生素檢測(cè)的方法主要有高效液相色譜法[5-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-14]等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其靈敏度高、重現(xiàn)性好、可同時(shí)快速檢測(cè)多種維生素已成為很多臨床實(shí)驗(yàn)室的***選方法。但是目前的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法血液需求量較大[10,13],檢測(cè)項(xiàng)目單***[8-9,14]或檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)[11],不能滿足臨床同時(shí)快速檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目的需求，特別是嬰幼兒采血困難采血量很難滿足需求。雖然已有部分學(xué)者建立微量檢測(cè)方法用于維生素檢測(cè)，但是這些方法需要衍生化過(guò)程，前處理復(fù)雜耗時(shí)較長(zhǎng)[8-9,14]。因此，建立能夠用微量血液同時(shí)快速檢測(cè)多種維生素的方法滿足臨床不同年齡段的檢測(cè)需求顯得尤為必要。

此外，視黃醇，維生素D的代謝產(chǎn)物25-OH-VD2、25-OH-VD3,α-生育酚是脂溶性維生素A、D、E在血液循環(huán)中的主要存在形式，常作為脂溶性維生素檢測(cè)的***選指標(biāo)[15-18]。γ-生育酚是維生素E主要的飲食攝入形式，但其與α-生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(α-TTP)的親和力較低，在體內(nèi)含量較α-生育酚低，但是，近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道其在人體健康活動(dòng)中也扮演著重要角色[19]。本文建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)快速檢測(cè)微量血清中視黃醇，維生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)和α-、β-、γ-生育酚的方法，滿足臨床各年齡段尤其是對(duì)嬰幼兒同時(shí)快速檢測(cè)多種維生素的需求。

１實(shí)驗(yàn)部分

１.１　 儀器與試劑　

１.２　 標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制　 

用無(wú)水乙醇配制視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液100μg/mL；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各1000μg/mL，并用紫外分光光度計(jì)對(duì)其濃度進(jìn)行校正[18,20]。用甲醇配制25-OH-VD2標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液25μg/mL和25-OH-VD3標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液100μg/mL，視黃醇-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液100μg/mL，25-OH-VD2-d3標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50μg/mL，25-OH-VD3-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液50μg/mL，α-生育酚-d6標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液1000μg/mL。

將各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用復(fù)溶液(初始流動(dòng)相)稀釋混勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(視黃醇2.50μg/mL、25-OH-VD2 0.20μg/mL、25-OH-VD3 0.40μg/mL、α-生育酚50.00μg/mL、β-生育酚5.00μg/mL、γ-生育酚 5.00μg/mL)；將各同位素標(biāo)品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋混勻，配制成混合內(nèi)標(biāo)工作液(視黃醇-d6 2.00μg/mL、25-OH-VD2-d3 0.10μg/mL、25-OH-VD3 0.20μg/mL、α-生育酚-d6 20.0μg/mL)。取4g BSA溶解于100mL水中配成4% BSA溶液。

１.３　 樣本前處理　 

取血清樣品20μL至2mL離心管中，加入10μL同位素內(nèi)標(biāo)工作液，80μL水，2000r/min渦旋振蕩30s后加入200μL甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，2000r/min混勻60s；加入800μL正己烷，2000r/min，混勻5min，然后4℃，12000r/min離心5min；吸取600μL上清液至1.5mL離心管中，室溫下氮?dú)獯蹈?；?00μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩60s，4℃，12000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待分析。

１.４　 色譜 － 質(zhì)譜條件　 

采用Phenomenex Kinetex F5(100mm × 2.1mm, 2.6μm)色譜柱，柱溫35℃，流動(dòng)相A含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液；流動(dòng)相B含2.5mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～2.0min，70%B，2.0～2.5min，70%～88% B，2.5～3.5min，88% B，3.5～3.51min，88%～81%B，3.51～11.0min，81% B，11.0～12.0min，81%～70%B，流速0.5mL/min。進(jìn)樣量：20μL。

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)、電噴霧正離子模式(ESI+)，離子源溫度 150℃，脫溶劑溫度500℃，毛細(xì)管電壓3kV，脫溶劑氣流速1000L/h；6種脂溶性維生素的MRM 離子參數(shù)見(jiàn)表1。

２　 結(jié)果與討論

２.１　 前處理?xiàng)l件優(yōu)化　 

２.２ 　 液 相 色 譜 條 件 優(yōu) 化 　 

Kinetex F5色譜柱可以實(shí)現(xiàn)所有組分包括β、γ-生育酚的分離。此外，25-OH-VD3同分異構(gòu)體3-epi-25-OH-VD3在嬰幼兒體內(nèi)含量較高，對(duì)維生素D含量測(cè)定影響較大[21]，該色譜柱可以實(shí)現(xiàn)25-OH-VD3和3-epi-25-OH-VD3的分離，減少3-epi-25-OH-VD3對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。故采用Kinetex F5色譜柱進(jìn)行所有組分的分離(見(jiàn)圖2)。研究發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入甲酸銨后其促進(jìn)目標(biāo)化合物離子化的效果較加入乙酸銨好，響應(yīng)值增加明顯，故在水相和有機(jī)相中均加入2.5mmol/L甲酸銨。

２.３　 線性范圍、檢出限和定量限　 

２.４　 方法精密度　

將低、中、高三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入4% BSA混合血清樣本經(jīng)本法處理后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)6次，連續(xù)檢測(cè)三天，計(jì)算日內(nèi)精密度為0.9%～9.6%，日間精密度為3.0%～9.3%(見(jiàn)表3)。該方法同時(shí)測(cè)定6種脂溶性維生素的日內(nèi)精密度和日間精密度均在15%以內(nèi)，方法精密度滿足檢測(cè)需求。

２.５　 方法準(zhǔn)確度　 

將低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入混合血清樣本中按本法進(jìn)行前處理后進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)6次，計(jì)算加標(biāo)回收率，3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為86.6%～107.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.46%～9.39%(見(jiàn)表4)。該方法加標(biāo)回收率均在80%～120%以內(nèi)，方法準(zhǔn)確度高滿足檢測(cè)需求。

采用建立的UPLC-MS/MS方法對(duì)美*********標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)制定的標(biāo)準(zhǔn)參照品SRM 968f進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)水平重復(fù)2次取平均值，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，除25-OH-VD2含量較低未能檢出外，其它檢測(cè)結(jié)果與靶值偏差均在5%以內(nèi)，該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠(表5)。

２.７　 實(shí)際樣品測(cè)定　 

使用本方法對(duì)17份健康兒童血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中視黃醇含量為0.22～0.43μg/mL，25-OH-VD2含量為未檢出～5.19ng/mL，25-OH-VD3含量為6.83～49.21ng/mL，α-生育酚含量為5.63～12.73μg/mL，β-生育酚含量為0.03～1.37μg/mL，γ-生育酚含量為0.11～1.68μg/mL。本法適用于微量臨床血液樣本6種脂溶性維生素的同時(shí)快速檢測(cè)。

３結(jié)　 論

本研究建立了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定微量血清樣本中多種脂溶性維生素的方法，并對(duì)前處理過(guò)程中的蛋白沉淀試劑、萃取液用量，復(fù)溶液等進(jìn)行了優(yōu)化，以減少色譜圖中噪音干擾，改善色譜峰形，提高檢測(cè)靈敏度。并比較了不同色譜柱對(duì)多種脂溶性維生素尤其是不同類型維生素E的分離效果，***終選擇Phenomenex Kinetex F5色譜柱，該色譜柱可以實(shí)現(xiàn)β-生育酚和γ-生育酚的有效分離。本研究中只需20μL血清就能夠快速完成6種脂溶性維生素的測(cè)定。該方法測(cè)定樣本需求量少、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確快速可實(shí)現(xiàn)大量臨床樣本的同時(shí)檢測(cè)，尤其對(duì)采血較為困難的嬰幼兒可以實(shí)現(xiàn)少量血液樣本檢測(cè)多數(shù)項(xiàng)目的需求。

(文章來(lái)源于互聯(lián)網(wǎng))