湖北大學(xué)王升富、文為教授課題組在《Applied Materials & Interface》期刊發(fā)表***新研究成果：“Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA?Peptide?DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells ” ，研究組提出了***種由肽核酸-肽- DNA共聚物引導(dǎo)的內(nèi)源性蛋白酶激活納米傳感器(PA-NS)，代替外源性引發(fā)劑在體外原位檢測(cè)低含量的癌癥生物標(biāo)志物，通過實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析技術(shù)，結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)和光學(xué)成像研究PA-NS在活腫瘤細(xì)胞中對(duì)miRNA-21 (miR-21)的光電雙模型檢測(cè)。

圖1.雙模態(tài)響應(yīng)的PA-NS在單個(gè)活腫瘤細(xì)胞中腫瘤特異性檢測(cè)miR-21的示意圖

要點(diǎn)1 PA-NS對(duì)miR-21體外光學(xué)傳感的評(píng)價(jià)

圖2.(a) PA-NS雙模態(tài)檢測(cè)miR-21示意圖。(b)在CaB激活或未激活的情況下，PA-NS對(duì)不同濃度miR-21反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。(c) PA-NS與miR-21和CaB單獨(dú)或聯(lián)合孵育的熒光強(qiáng)度。(d) PA-NS檢測(cè)miR-21的邏輯運(yùn)算真值表(添加和不添加miR-21或CaB分別定義為“1”和“0”)(e)不同濃度的PA-NS電化學(xué)檢測(cè)miR-21的I?V特性(插圖為I?log C的校準(zhǔn)曲線)

要點(diǎn)2單細(xì)胞水平上研究PANS探針的腫瘤特異性活性

研究組以腫瘤細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，健康細(xì)胞為對(duì)照組。如圖3b所示，利用CaB蛋白酶在腫瘤細(xì)胞中選擇性激活PA-NS系統(tǒng)，隨后通過與miR-21的位移反應(yīng)誘導(dǎo)FAM熒光團(tuán)的釋放。如圖3c所示，監(jiān)測(cè)到活化的PA-NS探針在活腫瘤細(xì)胞中有明顯的FAM熒光響應(yīng);PA-NS探針的成功激活可歸因于腫瘤細(xì)胞中CaB蛋白酶的過表達(dá)，HeLa細(xì)胞中miR-21的高水平進(jìn)***步觸發(fā)位移反應(yīng)。相比之下，由于CaB蛋白酶的低表達(dá)，PA-NS探針在健康細(xì)胞中被“鎖定”(圖3d)，表明PA-NS探針在健康細(xì)胞中不能被激活。如圖3e所示，PA-NS釋放的FAM的熒光響應(yīng)幾乎可以忽略不計(jì)，這表明PA-NS具有優(yōu)異的腫瘤特異性活性，在臨床癌癥診斷和治療方面可能具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。
      隨后，用微光纖(~ 10 μm)收集單個(gè)活腫瘤和健康細(xì)胞的熒光信號(hào)，進(jìn)***步證明了腫瘤特異性活性。***先，將PA-NS轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，再孵育3.5 h，激活探針并釋放FAM熒光信號(hào)。然后，利用三軸微操作系統(tǒng)將微光纖精確地附著在細(xì)胞膜上。在微光纖的輔助下，將495nm的激發(fā)光引導(dǎo)至單個(gè)活細(xì)胞，激活FAM熒光信號(hào)。如圖3f所示，微光纖輻照后細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活力幾乎不受影響，說明微光纖對(duì)細(xì)胞活性的影響可以忽略不計(jì)。然后用光電倍增管(PMT)收集并記錄單個(gè)活細(xì)胞的熒光信號(hào)。利用微光纖分別監(jiān)測(cè)單個(gè)腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞釋放的FAM信號(hào)。如圖3g所示，通過PMT獲取6個(gè)單個(gè)腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞釋放的FAM熒光信號(hào)，并用微光纖進(jìn)行定量分析。我們看到腫瘤細(xì)胞釋放的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于健康細(xì)胞，證實(shí)PA-NS在腫瘤細(xì)胞中可以被特異性激活，在健康細(xì)胞中處于“停止”狀態(tài)?？紤]到細(xì)胞的異質(zhì)性，從20個(gè)單個(gè)活腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞中收集相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，揭示了熒光強(qiáng)度的變化。如圖3h所示，在單細(xì)胞水平上，腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值比健康細(xì)胞高約3.4倍，比空白組高約5.1倍，這與熒光成像結(jié)果吻合良好。此外，健康細(xì)胞的熒光強(qiáng)度比空白組高~ 1.55倍，表明PA-NS具有令人滿意的腫瘤特異性活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的低背景信號(hào)。

圖3.(a)用Lip3000轉(zhuǎn)染PA-NS的過程。(b) PA-NS在腫瘤細(xì)胞中的活化過程。(d) PA-NS在健康細(xì)胞中的反應(yīng)。高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示PA-NS對(duì)腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)(c)和健康細(xì)胞(HUVEC細(xì)胞)(e)的反應(yīng)。(f)高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示靠近細(xì)胞的微光纖:(i)無激發(fā)的亮場(chǎng);(ii)在約490 nm處激發(fā);(iii)與赫斯特病毒孵育;(四)合并圖像。(g)利用微光纖檢測(cè)PA-NS在單個(gè)活腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞中的熒光響應(yīng)。(h)利用微光纖，PA-NS對(duì)單個(gè)活腫瘤細(xì)胞和健康細(xì)胞的對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度(490nm)箱形圖。標(biāo)尺:20 μm。

要點(diǎn)3 miR-21在單個(gè)活細(xì)胞中的原位光學(xué)定性和電化學(xué)定量分析

為了驗(yàn)證在單個(gè)活細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行光學(xué)和電化學(xué)檢測(cè)miR-21的可行性，***先，評(píng)估了用電極插入細(xì)胞并同時(shí)用微光纖將其連接到同***細(xì)胞上的操作可行性。如圖4a所示，在雙邊三軸微操作系統(tǒng)的幫助下，納米電極和微光纖被引導(dǎo)并移動(dòng)到同***個(gè)單細(xì)胞中。用微光纖監(jiān)測(cè)了單個(gè)腫瘤細(xì)胞60s內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化。如圖4b所示，觀察到***個(gè)“signal-on”熒光信號(hào)，熒光強(qiáng)度在60s內(nèi)趨于穩(wěn)定，說明FAM熒光信號(hào)具有良好的穩(wěn)定性和低背景信號(hào)?？紤]到細(xì)胞的異質(zhì)性，收集并測(cè)量了幾種腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。如圖4c所示，腫瘤細(xì)胞的熒光響應(yīng)比空白組高~ 5倍，證明PA-NS可以在腫瘤細(xì)胞中被激活，并借助微光纖實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的光學(xué)分析。接下來，評(píng)估了用修飾的Au NE在單個(gè)活細(xì)胞中電化學(xué)檢測(cè)miR-21的可行性。如圖4d所示，通過三軸微操作系統(tǒng)控制和引導(dǎo)修飾后的Au NE附著在細(xì)胞上，然后通過倒置顯微鏡上安裝的微操作器調(diào)節(jié)納米電極并插入細(xì)胞(圖4e)。考慮到細(xì)胞的異質(zhì)性，對(duì)15個(gè)單個(gè)活腫瘤細(xì)胞收集并分析相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。如圖4f所示，納米電極與腫瘤細(xì)胞孵育后，電化學(xué)信號(hào)下降了約40% (***P < 0.001;平均值±SD = 1.00±0.09 vs 0.62±0.09)，表明PA-NS涉及雙模型信號(hào)輸出平臺(tái)，可以檢測(cè)單個(gè)活腫瘤細(xì)胞中的miR-21。

圖4.(a)顯示插入單細(xì)胞的納米電極和用于單細(xì)胞光子數(shù)收集的光源引導(dǎo)的微光纖的顯微圖像。(b)微光纖采集的腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度。(c)使用微光纖對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行相應(yīng)的直方圖統(tǒng)計(jì)。納米電極在細(xì)胞外(d)和插入細(xì)胞內(nèi)(e)。(f) 15個(gè)單個(gè)活腫瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)的電流框圖。標(biāo)尺:20 μm。

實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀 

瑞明生物實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀主要性能

1、實(shí)時(shí)單細(xì)胞多指標(biāo)檢測(cè)：實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca2+、K+等）及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等），可匹配160余種商品化試劑盒；

2、實(shí)時(shí)亞細(xì)胞原位檢測(cè)：在亞細(xì)胞水平（胞質(zhì)、胞核、胞膜）實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)連續(xù)、原位檢測(cè)；

3、超微量提取、注射：?jiǎn)渭?xì)胞水平提取細(xì)胞器（如溶酶體、線粒體）、胞質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜或其它平臺(tái)的聯(lián)用分析；單細(xì)胞注射藥物、代謝劑等，并進(jìn)行藥效或機(jī)制評(píng)價(jià)；

4、活體水平檢測(cè)：活體水平實(shí)時(shí)檢測(cè)生化指標(biāo)（用藥前后、中醫(yī)藥針灸刺激前后）的變化。a

(文章來源于儀器網(wǎng))