由于微流控過程的可重復性、連續(xù)性和可擴展性，脂質(zhì)藥物遞送系統(tǒng)的微流控制備越來越受歡迎。盡管該領域取得了令人興奮的發(fā)展，但由于缺乏制備臨床相關的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體，微流控的多功能性和優(yōu)越性仍需要進***步的證據(jù)。本研究描述了使用交錯人字形混合器芯片(SHM)優(yōu)化不同剛度的PEG脂質(zhì)體配方。研究和討論了過程參數(shù)(總流量(TFR)和水與乙醇流量比(FRR))和配方參數(shù)(脂質(zhì)組分和組成、初始脂質(zhì)濃度和水介質(zhì))的影響。脂質(zhì)體配方包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DOPC)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DPPC)或1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿(DSPC)，成功制備了含有膽固醇和PEG化脂質(zhì)(DSPE-PEG2000)的脂質(zhì)體配方，具有理想的尺寸(～100 nm)和分散性(<0.2)。通過pH梯度遠程負載法，成功將阿霉素以高(>80%)的封裝效率封裝在這些脂質(zhì)體中，說明了其作為藥物遞送系統(tǒng)的雙層完整性和能力。我們證明了臨床相關的聚乙二醇化脂質(zhì)體配方可以制備出與傳統(tǒng)技術相當?shù)男阅?。我們還討論了聚乙二醇化脂質(zhì)體微流控生產(chǎn)的局限性和建議。

脂質(zhì)體是封閉的磷脂囊泡，已被臨床批準用于封裝各種治療和診斷。微流控技術已經(jīng)被探索用于以良好控制、可重復和高通量的方式制備脂質(zhì)體，從而克服了傳統(tǒng)技術的障礙，即批次間重復性低和通量有限。***近***個令人興奮的進展是交錯人字形微混合器(SHM)的發(fā)展，與傳統(tǒng)的微流體水動力聚焦(MHF)器件相比，它表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性(更高的通量，更快的混合和更小的稀釋)。

目前，有兩個障礙阻礙了微流控技術作為傳統(tǒng)技術的優(yōu)選技術的發(fā)展：沒有先前微流控知識和經(jīng)驗的研究人員在設計、選擇和操作微流控設備方面的障礙；以及對微流控技術是否能夠滿足其特定需求的擔憂，因為傳統(tǒng)方法已經(jīng)能夠提供。前者已經(jīng)通過微流控設備的商業(yè)化而得到緩解，而后者可以通過證明微流控技術在制備臨床相關的脂質(zhì)體配方方面與傳統(tǒng)方法相比的功能性來解決。

迄今為止，大多數(shù)臨床批準(和臨床試驗)的脂質(zhì)體配方是空間穩(wěn)定的，直徑為100-150 nm。與非PEG化脂質(zhì)體相比，PEG化脂質(zhì)體顯示出更高的穩(wěn)定性、更低的分散性和更長的血液循環(huán)時間。PEG化在臨床上的重要性已經(jīng)通過將PEG脂質(zhì)體納入臨床批準的脂質(zhì)體配方：Doxil?和Onivyde?得到證明。盡管對空間穩(wěn)定的藥物遞送系統(tǒng)有很高的需求，但大多數(shù)現(xiàn)有的微流體研究(不限于SHM)報告了非PEG化配方的生產(chǎn)。很少有研究報告了PEG化脂質(zhì)體的制備，這些脂質(zhì)體要么尺寸很小(約50 nm)，要么不穩(wěn)定，要么分散性高(>0.2)。例如，Zhigaltsev等人未能使用SHM微流體生產(chǎn)穩(wěn)定、均勻、高相變脂質(zhì)體(DPPC或HSPC)，并需要與不飽和脂質(zhì)混合以增強這些PEG化脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。此外，這些報告中的大多數(shù)只研究了總流速(TFR)和水乙醇流速比(FRR)對脂質(zhì)體質(zhì)量的影響，因為它們是脂質(zhì)體合成的***個工藝參數(shù)。這種方法可能已經(jīng)證明了微流控技術的魯棒性和簡單性，其中納米顆粒的優(yōu)化可以通過簡單地控制TFR和FRR來實現(xiàn)。另***方面，這可能表明我們對這種技術制備脂質(zhì)體的局限性缺乏知識。即，僅通過優(yōu)化加工參數(shù)，無法制備出具有***佳尺寸和分散性的配方。

到目前為止，這里已經(jīng)有少數(shù)研究報告單獨的配方參數(shù)的影響：選擇水和/或有機介質(zhì)；脂質(zhì)濃度；脂質(zhì)組分和組成對納米顆粒的制備。然而，關于***些參數(shù)的影響有矛盾的結果，可能由于微流控設備和調(diào)查值范圍的差異，導致難以做出結論性的比較。令人鼓舞的是，F(xiàn)orbes等人***近的研究使用SHM研究了制備溫度、脂質(zhì)濃度、脂質(zhì)組分和組成對非PEG化脂質(zhì)體的脂質(zhì)體大小和分散性的影響。在這里，我們已經(jīng)成功地證明了使用SHM制備的PEG化脂質(zhì)體配方具有理想的尺寸(約100 nm)和分散性(<0.2)。我們系統(tǒng)地研究了配方參數(shù)(水介質(zhì)、初始脂質(zhì)濃度、脂質(zhì)組分和組成)的影響，以及加工參數(shù)(TFR和FRR)。據(jù)我們所知，這是第***個使用SHM生產(chǎn)穩(wěn)定、均勻(約100 nm)的PEG化脂質(zhì)體的報告，包括液體和固體脂質(zhì)體配方，其中后者更具臨床意義。

微流控制備脂質(zhì)方法
采用交錯人字形微混合器（SHM）作為微流控裝置制備脂質(zhì)體。脂質(zhì)體溶解于乙醇中，制備適當濃度和摩爾比的脂質(zhì)混合物。制備脂質(zhì)體的水溶液包括去離子水(DW)、等滲生理鹽水(NS;0.9% w/v NaCl)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;10 mM磷酸鹽，0.8% w/v NaCl,pH 7.4)、HEPES緩沖鹽水(HBS;20 mM HEPES,0.8% w/v NaCl,pH 7.4)和硫酸銨((NH4)2SO4;240 mM,pH 5.4)。所有水溶液均通過0.22 μm聚醚砜注射器過濾器，然后注入SHM。

脂質(zhì)混合物的乙醇溶液和水介質(zhì)被注入到SHM中，其體積流速由兩個注射泵控制。實驗設置如圖1所示。對于由高熔點磷脂(DPPC和DSPC)組成的配方，使用加熱帶來保持乙醇和水溶液的溫度至少高于磷脂的凝膠到液態(tài)晶體相變溫度10°C(DPPC為51°C,DSPC為65°C)。從SHM的出口收集脂質(zhì)體，在室溫下隔夜透析去除乙醇，對1 L用于制備的相同水介質(zhì)，在不斷攪拌下，使用Pur-A-LyzerTM透析試劑盒。

表1：脂質(zhì)配方的組成

圖1. 水介質(zhì)對DOPC5大小和分散性的影響。在DW、NS和PBS中制備的10mM DOPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為1和2 mL/min,FRR為1。實線和虛線(〇)分別表示脂質(zhì)體Z平均直徑和分散性。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。與相同TFR的DW相比，所有均值之間的差異均以p < 0.05表示(LSD檢驗)。**，p < 0.01比較Z平均直徑。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比較分散性。

圖2.TFR和FRR對DOPC5大小和分散性的影響。在(a)NS和(b)PBS中制備的10mM DOPC5的Z-平均直徑和分散性，TFR為1和2 mL/min,FRR為1、2、3和5。實線和虛線(〇)分別表示脂質(zhì)體Z-平均直徑和分散性。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。所有均值之間的差異，p < 0.05表示(t檢驗)，比較TFR與相同的FRR。*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001比較Z-平均直徑。

圖3. 初始脂質(zhì)濃度對DOPC5大小和分散性的影響。在NS和PBS中制備的5、10、15mM的DOPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為1。實線和虛線(〇)分別表示脂質(zhì)體Z平均直徑和分散性。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。與10 mM相比，所有p < 0.05的均值差異均被標記(LSD檢驗)。#，p < 0.05；##，p < 0.01比較分散性。

圖4. FRR對DSPC5大小和分散性的影響。在NS或PBS中制備的10mM DSPC5的Z-平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為2、2.5、3和4。實線和虛線(〇)分別表示脂質(zhì)體Z-平均直徑和分散性。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。

圖6. 磷脂剛性對脂質(zhì)體大小和分散性的影響。在NS和PBS中制備的10mM DOPC5、DPPC5和DSPC5的Z平均直徑和分散性，TFR為2 mL/min,FRR為3。實線和虛線(〇)分別表示脂質(zhì)體Z平均直徑和分散性。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。所有均值之間的差異，在相同的水介質(zhì)中比較DSPC5,p < 0.05被標記(LSD檢驗)；*，p < 0.05；**，p < 0.01比較Z平均直徑。#，p < 0.05；##，p < 0.01；###，p < 0.001比較分散性。

表2：通過SHM裝置在不同水介質(zhì)(NS, PBS (pH 7.4)， HBS (pH 7.4)， and (NH4)2SO4 (pH 5.4))中制備的用于穩(wěn)定性研究的空間穩(wěn)定脂質(zhì)體配方的優(yōu)化流動條件，相應的流體動力直徑和分散性(初始脂質(zhì)濃度為10 mM)。數(shù)據(jù)代表至少三個獨立實驗的平均值±SD。

圖7. 微流控制備脂質(zhì)體的結構闡釋。(a)DOPC5，(b)DSPC2.5，和(c)DPPC5的透射電子顯微鏡(TEM)圖像，它們各自的***佳流條件，如表2中所述。制備的脂質(zhì)體具有直徑約100納米的水泡結構。比例尺為(a)200納米，(b,c)100納米。

我們系統(tǒng)地調(diào)查了所有可能影響空間穩(wěn)定脂質(zhì)體生產(chǎn)的因素。在此，我們提出了***個通用流程圖，作為定性建議，用于使用SHM微流控設計和優(yōu)化空間穩(wěn)定脂質(zhì)體配方(圖2)。 該流程圖是基于每個參數(shù)對所制備脂質(zhì)體的影響而安排的，并總結了改變加工和配方參數(shù)對所制備脂質(zhì)體的大小和分散性的影響。我們已經(jīng)表明，當我們用微流控優(yōu)化配方時，我們希望按照向下的方向設計每個參數(shù)，并從加工參數(shù)開始優(yōu)化每個參數(shù)。如果優(yōu)化加工參數(shù)不能解決遇到的問題，我們必須按照向上的方向修改配方；在***壞的情況下，改變脂質(zhì)組分。

我們的研究表明，通過控制加工和配方參數(shù)，所有三種PEG化配方都成功地制備了所需的尺寸(~100 nm)、分散性(< 0.2)和***終脂質(zhì)濃度(7.5 mM)，與傳統(tǒng)薄膜水合擠出法制備的配方相當。透射電鏡證實了優(yōu)化脂質(zhì)體的囊泡結構。通過pH梯度將DOX遠程裝載到脂質(zhì)體中進***步驗證了其膜完整性和作為藥物傳遞系統(tǒng)的能力。盡管DSPC5在分散性方面具有次優(yōu)特性，但它也能保持pH梯度，并具有令人滿意的DOX封裝效率。此外，雖然不飽和DOPC5和飽和DPPC5配方可以通過改變加工參數(shù)(TFR和FRR)以相對簡單的方式制備，但無論加工參數(shù)如何，DSPC5都是分散的(分散性> 0.2)。通過優(yōu)化配方參數(shù)，即DSPE-PEG2000的含量，制備了直徑小、分散性低的改良DSPC2.5配方。

(文章來源于儀器網(wǎng))