干貨分享 | 細胞凍存及復蘇避坑指南！

2024-03-28 09:33:42

細胞培養(yǎng)是生命科學實驗中離不開的實驗之***，它有廣泛的應用。細胞培養(yǎng)可以用于研究細胞的信號轉導、合成代謝、生長增殖等。細胞培養(yǎng)的常見實驗包括細胞復蘇、細胞傳代和細胞凍存等，其中細胞凍存及復蘇的過程對于細胞生長狀態(tài)有重要影響。

細胞凍存

細胞凍存的目的是為了減少細胞代謝，液氮（-196℃）凍存是常用的細胞凍存方法，細胞凍存時應遵循基本原則：控制降溫速率，要緩慢凍存。細胞凍存時，若不加入保護劑直接凍存，會對細胞造成嚴重損傷。如：

局部電解質(zhì)濃度改變，pH值改變，部分蛋白質(zhì)變性；
細胞內(nèi)冰晶形成，可引起溶酶體的損傷使溶解酶釋放，造成細胞內(nèi)結構成分的破壞、線粒體腫脹、功能喪失并造成細胞能量代謝障礙；
細胞膜上的類脂蛋白復合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起膜通透性改變，使細胞內(nèi)容物喪失；
細胞核在冷凍保存時也易受損。

為了降低在細胞凍存時對細胞的損傷，可以在凍存時加入凍存保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）（SKU：02196055）以降低對細胞損傷或死亡。DMSO作為滲透性細胞保護劑，其能夠迅速穿透細胞膜進入細胞中，防止細胞內(nèi)液冰晶的形成，以及防止細胞結構紊亂等。

二甲基亞砜（DMSO）結構式

研究表明，不同濃度的DMSO對細胞活力均有影響，DMSO濃度不超過10%時，對細胞的活力影響較小（如圖1）。除此之外，DMSO濃度為10%時，抑菌效果能夠接近***。在DMSO中加入適宜濃度的血清，有助于解凍后提高細胞收獲率和其功能活性的恢復。因此，細胞凍存時常常使用10%濃度的DMSO，可以在其中加入胎牛血清等作為保護劑，血清有助于解凍后細胞功能活性的恢復（如圖2為細胞凍存流程圖）。

圖1. DMSO濃度與細胞活力[1]

圖2. 細胞凍存操作流程圖

細胞凍存注意事項

1. 應選擇生長狀況良好的細胞進行凍存；

2. 凍存時細胞密度不能太低，推薦密度為100-300萬細胞/mL；

3. 凍存液中DMSO對細胞有所損傷，凍存過程要快，加入細胞凍存液后盡快進入降溫程序；

4. 不能將細胞懸液直接放在超低溫下快速冷凍；

5. DMSO屬于致癌物質(zhì)，使用時應戴好手套，規(guī)范操作。

細胞復蘇

細胞復蘇是指將凍存在液氮或低溫冰箱中的細胞解凍后重新培養(yǎng)，使其恢復生長的過程。細胞復蘇過程中，需要遵循快速融化的原則，這樣可以保證細胞外結晶短時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)再形成冰晶對細胞造成損傷。細胞復蘇后1-2天，細胞活性會逐漸得到恢復（如圖3為復蘇HEK293T細胞數(shù)對數(shù)值）。

細胞復蘇的主要實驗過程如下：

步驟1：從液氮容器或低溫冰箱中取出凍存管，迅速將其浸入37℃的溫水中，并不時搖動以使其盡快融化。37℃水浴時間盡可能短（1-2min），因為延長時間會增加細胞死亡率；
步驟2：當細胞完全融化后，從水浴中取出凍存管，用酒精棉球消毒外部，然后開啟瓶蓋；
步驟3：將細胞懸液轉移到離心管中，加入適量的培養(yǎng)液，并進行離心，以去除DMSO和死細胞；
步驟4：離心后，棄去上清液，用新的培養(yǎng)液重懸細胞，并計數(shù)，調(diào)整細胞密度；
步驟5：將細胞接種到培養(yǎng)瓶中， 37℃靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)初期，應注意觀察細胞狀態(tài)，以確保其正常生長。