肺癌是當(dāng)異常細(xì)胞在肺部以不受控制的方式生長時(shí)開始的***種癌癥。它是***個(gè)嚴(yán)重的健康問題，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的傷害和死亡,是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在男性和女性中的死亡率均為***高。目前，靶向治療是***種以干擾癌變或腫瘤增生所需的特定分子來阻止癌細(xì)胞增長的***種藥物療法，對于腫瘤中發(fā)現(xiàn)特定基因突變或生物標(biāo)志物的患者來說，是***種重要的選擇。

***近，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院林志強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在***際知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=15.1）發(fā)表***篇題為“An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target protein cleavage activity and synergistic antitumor effect”的文章。該研究借鑒金屬離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和活性的方式，采用基于金屬輔因子的方法，以胰腺彈性蛋白酶(PPE，ELANE 同系物)為模型藥物，增強(qiáng)靶蛋白裂解和抗腫瘤效應(yīng)。作者體外開發(fā)并優(yōu) 化了***種具有增強(qiáng)裂解活性的彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)，借助玉研肺部霧化給藥裝置定量靶向給予到小鼠肺部，CAEN阻止了PPE在生物環(huán)境中的降解，并有效地將其傳遞給腫瘤細(xì)胞。通過有效裂解跨膜蛋白CD95(與游離PPE相比具有更高的特異性)，CAEN在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的凋亡。

CAEN主要通過無創(chuàng)霧化吸入進(jìn)入肺組織，實(shí)現(xiàn)肺組織特異性蛋白藥物傳遞(圖1)。在腫瘤細(xì)胞中，從CAEN釋放的PPE與Mn2+嵌合體特異性裂解腫瘤細(xì)胞的跨膜蛋白CD95，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且釋放的Mn2+能有效增強(qiáng)肺部腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

圖1 彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)

由于血液中存在多種絲氨酸蛋白酶，因此在實(shí)際應(yīng)用中可能會抑制PPE的活性。作者為了驗(yàn)證CAEN對血清的敏感性，在不同細(xì)胞系中使用了含或不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示。CAEN組在使用含或不含血清培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性作用。

圖2 不同制劑（含或不含血清）處理后的細(xì)胞存活率

上述實(shí)驗(yàn)表明設(shè)計(jì)的CAEN能夠穩(wěn)定PPE的活性，防止其受到血清中蛋白酶抑制劑的抑制，達(dá)到完全的抗腫瘤效果。這充分說明金屬離子的礦化改性策略有望提供***種保護(hù)PPE活性的方法，CAEN的生物礦化作用為這類功能蛋白在抗腫瘤治療中的有效活性提供了納米屏障。

為了驗(yàn)證不同制劑組裂解CD95的能力，作者純化了MBP-CD95蛋白并進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)。***先，將不同制備組與MBP-CD95蛋白孵育30min，結(jié)果見圖3兩組之間的差異在于PPE組完全裂解WBP-CD95，而CAEN組僅選擇性裂解CD95蛋白。因此，彈性蛋白酶與錳離子的生物礦化復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性裂解。

圖3 不同制劑與MBP-CD95體外切割效果驗(yàn)證

作者在B16-F10腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CAEN治療組發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞比例***顯著，表明CAEN具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

圖4 不同制劑凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析

上述實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了CAEN裂解靶蛋白的潛力及其抗腫瘤作用。

研究表明，與靜脈給藥相比，吸入和遞送治療藥劑可對局部惡性腫瘤組織實(shí)現(xiàn)更好的治療效果，并降低不相關(guān)的全身效應(yīng)的可能性。在文章中，作者使用玉研儀器公司的肺部霧化給藥裝置（YAN-30012）對小鼠肺部定量輸送CAEN制劑。

為了驗(yàn)證霧化裝置能夠成功給藥，作者使用考馬斯亮藍(lán)溶液(CBB)作為指示劑來證明藥物可以有效地進(jìn)入小鼠的肺組織。圖5可以觀察到小鼠肺組織中有明顯量的CBB液，主要均勻分布在氣管、支氣管。因此，肺部霧化給藥有望有效實(shí)現(xiàn)納米粒子的局部遞送和組織器官的特異性治療。

圖5 考馬斯亮藍(lán)溶液已被霧化吸入

為了檢驗(yàn)CAEN在肺部的滯留，作者使用Cy7熒光染料標(biāo)記的PPE和CAEN進(jìn)行肺部霧化給藥，并取出肺組織用于熒光成像觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用肺部霧化給藥方法可使CAEN均勻進(jìn)入肺組織。

圖6 不同制劑（含或不含血清）處理后的細(xì)胞存活率

此外，作者還評估了肺部霧化給藥后不同制劑在肺組織中的跨粘膜吸收行為。吸入PPE-Cy7和CAEN-Cy7后24小時(shí)，處死小鼠，采集肺進(jìn)行熒光成像。熒光成像如圖所示，在用CAEN-Cy7處理的肺中觀察到更強(qiáng)和更深的熒光分布，表明礦化納米顆粒作為載體表現(xiàn)出優(yōu)異的滲透和保留能力，能夠顯著改善生物大分子蛋白的跨粘膜通透性和截留率。

圖7 各組離體器官和肺組織切片熒光成像結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與游離蛋白相比，CAEN能提高細(xì)胞攝取效率，并延長蛋白在局部組織中的保留時(shí)問。

為驗(yàn)證CAEN的抗腫瘤作用，C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞，形成肺癌模型。在第5、9、13、17天使用玉研肺部霧化給藥裝置給小鼠肺部給藥，進(jìn)行局部抗腫瘤治療。在第5、13和21天，解剖小鼠并收集其肺組織。隨后，作者計(jì)數(shù)了小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶（圖8）。CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了優(yōu)異的治療效果，無明顯轉(zhuǎn)移。PPE組出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移灶，這可能是由于PPE氣霧劑吸入無法有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使肺組織表面的彈性纖維降解，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤組織H&E染色顯示（圖9），CAEN給藥組小鼠組織切片中癌細(xì)胞較少，而PBS組和PPE組中癌細(xì)胞較多。

圖8 小鼠肺部給藥示意圖

圖9 使用PBS、PPE和CAEN治療的小鼠肺組織圖像和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量

圖10 肺組織轉(zhuǎn)移灶的H&E染色組織學(xué)檢查

健康小鼠經(jīng)同樣處理后（圖11），發(fā)現(xiàn) PPE處理組對健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN處理組和PBS處理組無明顯變化。PPE蛋白對肺組織的損傷有利于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，這也解釋了PPE治療組小鼠在第21天出現(xiàn)嚴(yán)重腫瘤病變的原因。

圖11 未接種腫瘤的小鼠經(jīng)同樣處理后肺組織的H&E染色結(jié)果

TUNEL染色（圖12）證實(shí)CAEN有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中CAEN組CD8+T細(xì)胞比例***高，提示其在肺腫瘤組織中有高度浸潤，有利于殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖12 各組小鼠肺組織TUNEL和CD8+T細(xì)胞染色結(jié)果

CAEN可以通過肺部霧化給藥實(shí)現(xiàn)器官特異性遞送，擴(kuò)大了PPE蛋白的應(yīng)用范圍。在動物實(shí)驗(yàn)中，CAEN在錳離子的輔助下，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

豬胰腺彈性蛋白酶(PPE)作為***種新型的抗腫瘤蛋白藥物，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。然而，由于其固有的缺陷，PPE在腫瘤治療中的應(yīng)用受到限制，在本研究中，作者設(shè)計(jì)并制備了***種切割活性增強(qiáng)的彈性蛋白酶納米復(fù)合體(CAEN)，該復(fù)合體含有Ca2+、PPE及其輔因子(Mn2+)以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性切割。CAEN不僅有效地保護(hù)和穩(wěn)定了PPE蛋白的活性，而且在不同類型的癌細(xì)胞中也表現(xiàn)出有效的殺傷作用。通過玉研肺部霧化給藥裝置，有效實(shí)現(xiàn)了納米粒子CAEN在小鼠肺部的定量***靶向遞送和肺部組織器官的特異性治療效果。CAEN中金屬離子的釋放影響了肺部腫瘤細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高和線粒體損傷。結(jié)合Mn2+的免疫激活功能，CAEN在體內(nèi)外均能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，具有良好的生物安全性?？傊?，該研究為蛋白質(zhì)藥物在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供了有效的研究思路。

通堵裝置是***種玉研儀器***新設(shè)計(jì)，用于清除肺部給藥裝置針頭管道內(nèi)的堵塞物，和保證肺部給藥裝置內(nèi)管道暢通的工具。