探索大腦的秘密：原代皮層和海馬神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)全解析
產(chǎn)品體驗(yàn)官 瑞沃德「 細(xì)胞與分子生物新星創(chuàng)作計(jì)劃 」火熱進(jìn)行中，我們將不定期刊登入選文章。除了給廣大細(xì)胞分子科研工作者提供***個(gè)展示、交流和學(xué)習(xí)的平臺(tái)外，合格文章的作者，也將獲得藍(lán)牙降噪耳機(jī)、膠囊咖啡機(jī)等禮品，點(diǎn)擊文末圖片即可參加~ 以下投稿內(nèi)容來(lái)自廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的陳醫(yī)生，***起探究原代皮層和海馬神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)吧！
原代皮層和海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 神經(jīng)科學(xué)作為***個(gè)重要的學(xué)科，研究神經(jīng)元的功能和結(jié)構(gòu)對(duì)于了解人類(lèi)大腦的工作機(jī)制以及治療神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。 原代皮層和海馬神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是神經(jīng)科學(xué)研究中的***種常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)培養(yǎng)神經(jīng)元，我們可以研究它們?cè)诓煌砗筒±頎顟B(tài)下的行為和功能。本次我們將詳細(xì)介紹原代皮層和海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)全流程，從神經(jīng)元的獲取、培養(yǎng)、觀察等各個(gè)環(huán)節(jié)，為神經(jīng)科學(xué)研究者提供實(shí)用的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和參考。
01 培養(yǎng)前準(zhǔn)備： ? 高壓滅菌：器械包，槍頭盒（1mL，200ul，10ul），紗布，超純水。提前高壓滅菌，滅菌后的物品盡量在 1 周內(nèi)使用。 ? 細(xì)胞板包被：用 0.1mg/mL 多聚賴(lài)氨酸(貨號(hào)：sigma：P1024)提前 1-2 天包被細(xì)胞板,次日用超純水清洗細(xì)胞板 3 次，培養(yǎng)箱中烘干備用。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)基配備： 含F(xiàn)BS 的DMEM： DMEM 40mL+F-12 5mL+FBS 5mL+雙抗 500ul Neurobasal：Neurobasal 48.5mL+B27 1mL+谷氨酰胺 250ul（0.5mM） 02 動(dòng)物：購(gòu)買(mǎi)孕鼠（孕 16-18 天）或 1-3 天新生鼠。 03 紫外消毒工作臺(tái)，之前高壓滅菌的器械包，槍頭盒，紗布，超純水等。工作臺(tái)和細(xì)胞間的紫外同時(shí)開(kāi)啟 30 min 后，通風(fēng) 10 min。 04 取胎鼠：酒精消毒工作臺(tái)，氣體麻醉孕鼠，以“Y”字形剪開(kāi)孕鼠下腹部， 取出完整子宮，避免子宮破裂。將完整的子宮放入***個(gè)干凈的器皿（10 cm 細(xì)胞皿），酒精消毒器皿外部后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房。 05 取胎鼠腦：將所有的胎鼠腦全部取出，放入***個(gè)裝滿 DMEM 的 10 cm 皿內(nèi)，10 cm 皿放在 1 個(gè)冰盒上（新生鼠則泡酒精后直接取腦）。 06 顯微鏡下分離提取腦海馬或皮層組織：取***個(gè)胎鼠腦至 35mm 的小皿中，皿內(nèi)裝有 DMEM，將胎鼠腦放置為背側(cè)面朝上，用鑷子沿中線分開(kāi)左右兩側(cè)， 用鑷子固定住胎鼠腦，用另外 1 個(gè)鑷子將皮質(zhì)向外側(cè)撥開(kāi)，暴露出海馬，剝離血管膜（盡量剝干凈可有效減少成纖維細(xì)胞干擾），分離出海馬段。將分離出的海馬段放置于***個(gè) 35mm 小皿內(nèi)，小皿裝有 DMEM，小皿放在冰盒上。 07 胰酶消化海馬組織。將裝有全部海馬組織的小皿轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)操作，放在***個(gè)冰盒上操作，將小皿側(cè)放，用 1mL 槍吸干凈皿內(nèi) DMEM，然后用眼科剪將海馬剪碎，約剪成 1mm3 的肉糜狀，加入適量的胰酶（***般 1 只孕鼠取出的胎鼠海馬，用 2mL 胰酶），適當(dāng)將海馬組織碎搖勻散開(kāi)，盡快放入至 37°培養(yǎng)箱，消化 15min。若組織較多，適當(dāng)加長(zhǎng)消化時(shí)間。 08 終止消化。將小皿取回至工作臺(tái)的冰盒上，加入 2mL DMEM 終止消化，將皿內(nèi)所有液體轉(zhuǎn)移至***個(gè) 15mL 離心管。 09 離心。用 1mL 槍吹打混勻海馬組織懸液，1500rpm，離心 3min，需要用另外***個(gè) 15 mL 離心管裝 4mL 廢液進(jìn)行配平。 10 制備細(xì)胞懸液：將離心后的離心管取出，棄去上清液，留沉淀，加入 1mL DMEM，用 1mL 槍頭吹打均勻，約吹打 10-15 次，靜置 1min 后，取上清液至***個(gè)新的 15mL 離心管，這***步重復(fù) 2 遍，將獲得 3-4mL 細(xì)胞懸液。 11 種板：用含 FBS 的 DMEM 制備合適的種板細(xì)胞懸液，種板。6 孔板種板密度為 7.5 X105 個(gè)/mL，12 孔板種板密度為 4X105 個(gè)/mL。放入 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 12 4-6 h 后換液，將含 FBS 的 DMEM 全部換為 Neurobasal。 13 細(xì)胞換液。***般 2 天換液***次，建議第 2 天進(jìn)行阿糖胞苷處理。24h 后用Neurobasal 全量換液，第 7-8 天進(jìn)行 OGD 或其他后續(xù)處理。 14 可用 MAP2 進(jìn)行神經(jīng)元的純度驗(yàn)證，如下圖： 腦組織解離不止有手工酶解方法，【RWD單細(xì)胞懸液制備儀】全自動(dòng)解離神經(jīng)組織助力用戶(hù)神經(jīng)研究。可以將大小鼠腦組織溫和、快速、高效地制備成單細(xì)胞懸液，同時(shí)保留細(xì)胞重要的表面抗原表位。獲得的單細(xì)胞懸液可繼續(xù)用于原代細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞分選等下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
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