揭穿免疫沉淀“四大誤解” Dynabeads磁珠讓免疫沉淀實(shí)驗(yàn)事半功倍
免疫沉淀實(shí)驗(yàn)想必大***并不陌生，采用瓊脂糖珠作為介質(zhì)更是免疫沉淀的常用方法。瓊脂糖珠介質(zhì)歷來有***些難以克服的挑戰(zhàn)，導(dǎo)致人們對免疫沉淀持有***些并非總是正確的普遍看法。如何能讓免疫沉淀實(shí)驗(yàn)事半功倍，自然需要對 “四大誤解”有深入了解。
誤解1：背景是不可避免的 要理解這個“誤解”，***先需要知道什么是背景以及它的來源。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中的背景是***種額外的非特異性信號，與抗原或相關(guān)蛋白質(zhì)的質(zhì)量大小不***致。背景主要由兩個原因引起：1) 未將上清液與顆粒/樹脂或珠子清晰分離；2) 瓊脂糖或 Sepharose 樹脂的孔隙。當(dāng)使用Sepharose或瓊脂糖樹脂的混懸液法時(shí)，是沒有明確沉淀物的。因此，研究人員可能會意外地去除過多的混懸液（和寶貴的樣品），或者去除不足，導(dǎo)致樣品中含有可能提升背景的不需要的蛋白質(zhì)。多孔的Sepharose/瓊脂糖樹脂會吸附液體，以及不需要的蛋白質(zhì)。即使進(jìn)行了多次洗滌，仍然很難去除干擾性蛋白質(zhì)，導(dǎo)致背景較高。 小貼士：如何減少免疫沉淀中的背景 Dynabeads磁珠可以被磁化，與磁力架***起使用時(shí)，可輕松將其拉到樣品管的***側(cè)。這***特點(diǎn)使得移除緩沖液或上清液變得非常容易，不會造成任何破壞或樣品損失。 Dynabeads磁珠的***個關(guān)鍵特點(diǎn)是其表面清晰，沒有孔隙。所有的結(jié)合都發(fā)生在外表面，從而防止任何不需要的蛋白質(zhì)被困在內(nèi)部。 為了進(jìn)***步減少免疫沉淀中的背景，建議徹底洗滌含有感興趣蛋白質(zhì)的磁珠，以去除任何不需要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。 圖1. 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠與其他供應(yīng)商的對比。進(jìn)行Western blot來比較使用1）Sepharose離心柱、2）Sepharose混懸液、3）瓊脂糖混懸液和離心柱、4）樹脂離心柱、5）Dynabeads Protein A磁珠的方案時(shí)間和背景的差異（每種方法***式兩份）。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少節(jié)省14分鐘的時(shí)間。 誤解2：為獲得高質(zhì)量的免疫沉淀結(jié)果，必須對樣品溶液進(jìn)行預(yù)清除 這個誤解認(rèn)為，非目標(biāo)蛋白的其他蛋白質(zhì)可能會與固相發(fā)生非特異性結(jié)合。為了解決這個問題，通常會進(jìn)行預(yù)清除步驟，即將固相（不含抗體）加入樣品中***段時(shí)間，然后移除，以去除不需要的非特異性蛋白質(zhì)和背景。然而，進(jìn)行免疫沉淀的預(yù)清除步驟需要使用雙倍量的固相，并增加了整個免疫沉淀方案所需的時(shí)間。 小貼士：無需預(yù)清除樣品溶液，即可避免背景干擾 使用 Dynabeads 磁珠與特異性抗體偶聯(lián)后，無需預(yù)清除，因?yàn)樗⒉蛔R別非特異性蛋白質(zhì)。這種方法不僅節(jié)省了***半的固相使用量，還減少了實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間。 圖2. 不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads Protein G磁珠與進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠之間的背景水平比較。進(jìn)行Western blot來比較兩種方法的背景水平，1）進(jìn)行預(yù)清除的Sepharose Protein G珠和2）不進(jìn)行預(yù)清除的Dynabeads Protein G磁珠（每種方法的樣品***式八份）。結(jié)果顯示，使用Dynabead Protein G磁珠進(jìn)行免疫沉淀能始終沉淀出更多的相關(guān)蛋白。 誤解3：更高的結(jié)合能力對免疫沉淀更好 這個誤解是基于瓊脂糖和Sepharose珠子的抗原結(jié)合能力。瓊脂糖和Sepharose珠子具有外表面和內(nèi)表面，蛋白質(zhì)可以結(jié)合的區(qū)域很大，從而導(dǎo)致高結(jié)合能力。這種高結(jié)合能力意味著這些珠子和樹脂也可以與樣品中的其他蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合。研究人員在選擇IP技術(shù)時(shí)需要在結(jié)合能力、產(chǎn)量、特異性和成本之間取得平衡。 小貼士：平衡結(jié)合能力、產(chǎn)量和特異性 可以使用磁珠，磁珠外表面與能識別相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 μg的抗體，因此并不需要高結(jié)合能力的試劑，而且成本效益不高。只需使用實(shí)驗(yàn)所需的確切量即可，這樣可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)室的抗體、試劑和免疫沉淀磁珠。 誤解4：高質(zhì)量的磁珠價(jià)格昂貴 研究人員可能會認(rèn)為Dynabeads磁珠價(jià)格昂貴，而瓊脂糖/ Sepharose混懸液則更具成本效益。然而，如果考慮到磁珠不需要預(yù)清除步驟，那么每個樣品的價(jià)格是相當(dāng)?shù)?，甚至可能更低?br/> 在計(jì)算免疫沉淀的成本時(shí)，研究人員可能會考慮固相的成本與固定體積固相的結(jié)合能力。然而，正如我們在誤解3中了解到的，固相的高結(jié)合能力對于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)并不關(guān)鍵，可能是多余的，導(dǎo)致使用更多昂貴的抗體。 小貼士：計(jì)算使用 Dynabeads 磁珠節(jié)省的成本 計(jì)算免疫沉淀成本的正確方法是查看進(jìn)行***次免疫沉淀所需的磁珠和抗體的***低用量。由于瓊脂糖/ Sepharose混懸液通常需要預(yù)清除，因此這些珠子的成本必須加倍。由于Dynabeads磁珠具有較少的非特異性結(jié)合且不需要預(yù)清除，因此在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中使用Dynabeads磁珠比使用瓊脂糖/ Sepharose珠更具成本效益。 可以說，利用磁珠的免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展幫助科學(xué)界克服了關(guān)于免疫沉淀的特定誤解，從而為需要優(yōu)化其免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的科學(xué)***提供了支持。
(文章來源于儀器網(wǎng))
