膠原蛋白重組大公開(kāi)，讓CHO cell承“胞”你的美！
古今中外，愛(ài)美之心人皆有之，人們通過(guò)食補(bǔ)、醫(yī)美等方式來(lái)維持肌膚吹彈可破，光澤飽滿(mǎn)的狀態(tài)。在醫(yī)美中，注射類(lèi)產(chǎn)品包括膠原蛋白類(lèi)、玻尿酸類(lèi)、以聚乳酸代表的再生制劑類(lèi)、肉毒素類(lèi)，以及新興起的外泌體類(lèi)等類(lèi)別。其中，膠原蛋白作為人體各種組織內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 主要成分，以其優(yōu)良的生物相容性備受消費(fèi)者青睞。
膠原蛋白由三條多肽α鏈組成的獨(dú)特三螺旋結(jié)構(gòu)，每條α鏈約有1014個(gè)氨基酸，分子量約為300 KDa。***般α鏈?zhǔn)侵貜?fù)的氨基酸序列甘氨酸-X-Y結(jié)構(gòu)，X和Y多數(shù)為脯氨酸 (Pro) 和羥脯氨酸 (Hyp) [1]。目前已發(fā)現(xiàn)人體中含有28種不同的膠原蛋白，各具有不同的高***結(jié)構(gòu)。膠原蛋白類(lèi)型按照發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序以羅馬數(shù)字命名 (I–XXVIII) 命名，而在我們的皮膚中，I型、III型、Ⅴ型、Ⅵ型膠原蛋白占據(jù)較大比例。
圖1：天然膠原蛋白結(jié)構(gòu)
什么是更佳的膠原蛋白提取方式？
傳統(tǒng)膠原蛋白從動(dòng)物結(jié)締組織中提取獲得，提取方法主要包括高壓輔助的物理方法、溶劑抽提的化學(xué)方法、酶的生物化學(xué)法。但以上方法提取出來(lái)的膠原蛋白存在動(dòng)物源疾病等風(fēng)險(xiǎn)。而重組膠原蛋白具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，重組膠原蛋白變形溫度在72℃以上，遠(yuǎn)高于動(dòng)物源膠原蛋白的40℃，更易運(yùn)輸和儲(chǔ)存，在醫(yī)美行業(yè)中使用更為廣泛。重組表達(dá)系統(tǒng)包括如大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等。但以大腸桿菌和酵母為體系生產(chǎn)出來(lái)的膠原蛋白容易出現(xiàn)氨基酸序列簡(jiǎn)單重復(fù)，無(wú)羥基化修飾等問(wèn)題，在常溫條件下其三螺旋結(jié)構(gòu)松散，甚至呈現(xiàn)出單鏈線性結(jié)構(gòu)。 CHO細(xì)胞作為***具代表性的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，具有準(zhǔn)確的重組蛋白翻譯后修飾，表達(dá)出的蛋白在理化特性和生物學(xué)功能***接近天然蛋白。在生產(chǎn)重組蛋白藥物生產(chǎn)中有著悠久的歷史。CHO細(xì)胞表達(dá)的重組膠原蛋白能完美還原天然膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，即使在常溫條件下其三螺旋結(jié)構(gòu)仍能緊密維持。
案例分享
1997年，F(xiàn)ukuda等人[2]***次發(fā)表CHO細(xì)胞表達(dá)IV型膠原蛋白 [α1(IV)] 2α2 (IV) 。研究人員使用CHO DHFR缺陷型細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，***先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后進(jìn)行加壓 (MTX) 篩選，終克隆A222可高表達(dá)α1 (IV) ，隨即將表達(dá)α2 (IV) 的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染克隆A222細(xì)胞以獲得CHO A222-A2細(xì)胞，即可同時(shí)表達(dá) [α1(IV)] 和α2 (IV) 。
圖2：α1 (IV) 2和α2 (IV) 的合成和分泌。Lane A-C：培養(yǎng)上清，Lane D-I：細(xì)胞裂解物。G和H：還原條件，A-F，I：非還原條件。Lane A，D：MT-7 CHO細(xì)胞，lane B，E和G：CHO A222細(xì)胞，lane C，F(xiàn)和G：CHO A222-A2細(xì)胞，lane I：細(xì)菌膠原酶消化CHO A222-A2細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。
從SDS-PAGE結(jié)果可以看出，CHO A222細(xì)胞可表達(dá)185 KDa大小的單鏈α1 (IV) （圖2.F）。同樣，在CHO A222細(xì)胞的培養(yǎng)基上清中可檢測(cè)到有185 KDa的大小的α1 (IV) （圖2.G）。Control CHO MT7細(xì)胞未合成α1 (IV) 或α2 (IV)（圖2.A&D）。另外，表達(dá)的α1 (IV) 應(yīng)該是單鏈結(jié)構(gòu)，因?yàn)樵趫D2.B&E中未見(jiàn)更大分子量的蛋白存在。這些結(jié)果表明CHO A222細(xì)胞產(chǎn)生的單鏈α1 (IV) 會(huì)外泌出細(xì)胞。CHO MT7細(xì)胞在感染后會(huì)表達(dá)出170 KDa的單鏈α2 (IV) ，但不會(huì)形成三聚體 (data not shown) 。CHO A222-A2細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)α1 (IV) 和α2 (IV)（圖2.C、F、H），此外，在lane C和F的非還原條件中出現(xiàn)***條大于300 KDa的條帶，但在還原條件下（圖2.H）此條帶消失且170 KDa條帶增強(qiáng)。此條帶只在CHO A222-A2細(xì)胞中產(chǎn)生，且在經(jīng)過(guò)膠原蛋白酶處理后與α1 (IV) 和α2 (IV) 條帶均消失，因此可以確定CHO A222-A2細(xì)胞表達(dá)出IV型膠原蛋白，且后續(xù)實(shí)驗(yàn)也有進(jìn)***步驗(yàn)證 (data not shown) 。 膠原蛋白的羥基化修飾對(duì)維持膠原蛋白的穩(wěn)定性有重要作用，在斯坦福大學(xué)Marinkovich教授等人著作專(zhuān)利中[3]，研究人員將編碼脯氨酰4-羥化酶 (prolyl 4-hydroxylases, P4Hs) 的質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)進(jìn)CHO細(xì)胞中，并挑選出穩(wěn)轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞株。
圖3：編碼脯氨酰4-羥化酶的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)
CHO細(xì)胞在無(wú)選擇壓力情況下，培養(yǎng)至20代時(shí)，VII型膠原蛋白仍能穩(wěn)定表達(dá)，這將有利于重組膠原蛋白的GMP生產(chǎn)（圖4）。
圖4：CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)VII型膠原蛋白
CHO細(xì)胞在生產(chǎn)重組膠原蛋白時(shí)，可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的組分和補(bǔ)充***些因子以提高細(xì)胞產(chǎn)量。在江蘇創(chuàng)健醫(yī)療的公開(kāi)專(zhuān)利中[4]，
***先結(jié)合控制甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸含量促進(jìn)膠原蛋白合成； 進(jìn)而引入維生素C和Fe2+的結(jié)合，維持Fe2+不被氧化成有毒性的Fe3+； 同時(shí)結(jié)合優(yōu)化維生素、微量元素和補(bǔ)充因子。
此外引入了重組小分子膠原蛋白，進(jìn)***步促進(jìn)膠原蛋白的高效表達(dá)，其中重組小分子膠原蛋白75?200 mg/L。
總 結(jié) 目前***內(nèi)多***公司布局CHO細(xì)胞重組膠原蛋白平臺(tái)，致力于生產(chǎn)出更優(yōu)質(zhì)的膠原蛋白產(chǎn)品。HyClone作為旗下培養(yǎng)基子品牌，在CHO培養(yǎng)基領(lǐng)域深耕多年，旗下有***產(chǎn)品ActiPro+7ab組合以及其他培養(yǎng)基。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
