細(xì)菌生物膜是大量存在的三維活性物質(zhì)，具備執(zhí)行復(fù)雜的生物力學(xué)和生物化學(xué)功能的能力，包括可編程生長、自我修復(fù)、過濾以及生物生產(chǎn)。然而，***直以來，都缺少能夠在細(xì)胞尺度上具備空間分辨率的在體測量生物膜內(nèi)部力學(xué)特性的方法。在此，在不同的應(yīng)力振幅、周期和生物膜大小的各種條件下，在施加剪切應(yīng)力期間和之后，對霍亂弧菌的活體三維生物膜內(nèi)的數(shù)千個細(xì)胞進(jìn)行了追蹤，這揭示了細(xì)胞位移和細(xì)胞重新定向的各向異性彈性和塑性響應(yīng)。利用細(xì)胞追蹤來推斷通用力學(xué)模型的參數(shù)，獲取了生物膜內(nèi)部彈性模量的空間分辨測量值，其與生物膜基質(zhì)內(nèi)多糖的空間分布存在關(guān)聯(lián)。此處引入的無創(chuàng)微流變學(xué)和力推斷方法為研究活體材料中具有高空間分辨率的力學(xué)性能提供了***個通用框架。

據(jù)估計(jì)，細(xì)菌生物膜群落乃是地球上***為豐富的生物材料，且在人類健康領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，涵蓋從腸道微生物組到各類感染。于生物工程和材料科學(xué)中，生物膜當(dāng)下正作為典型的可編程多功能活性材料而被深入探究，其整合了機(jī)械穩(wěn)固性與適應(yīng)性，以及自我修復(fù)和化學(xué)合成的能力。盡管生物膜是具備廣泛技術(shù)潛能的材料，然而在醫(yī)療場所和工業(yè)管道里，細(xì)菌生物膜亦可能構(gòu)成問題，因?yàn)樗鼈儗τ诳股?、消毒劑和機(jī)械應(yīng)力具有高度的耐受性。故而，控制生物膜的生長和機(jī)械性能對于技術(shù)應(yīng)用以及清除感染和工業(yè)中不受歡迎的生物膜而言，乃是重要的挑戰(zhàn)。

生物膜通常為在表面生長的三維結(jié)構(gòu)，其生長方式或是消耗表面內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，或是消耗表面上方水相中的營養(yǎng)物質(zhì)。在細(xì)菌生物膜中，細(xì)胞借助由蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)構(gòu)成的自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)彼此相連并附著于表面，共同形成***種復(fù)雜且具備機(jī)械彈性的材料結(jié)構(gòu)。不同細(xì)菌物種的生物膜，其基質(zhì)的確切分子組成存在差異。生物膜去除所具有的工業(yè)和醫(yī)學(xué)重要性致使針對宏觀尺度（100 μm - 10 cm）下整個生物膜的整體材料特性展開了多項(xiàng)研究，明確了特定基質(zhì)成分的重要作用。依據(jù)生物膜的整體材料特性，強(qiáng)流體流動已被證實(shí)會顯著改變生物膜的形狀，包括對于產(chǎn)生粘彈性生物膜的細(xì)菌物種形成生物膜飄帶。

盡管針對整個生物膜的全球材料屬性已獲取了重要的洞見，但對于生物膜內(nèi)材料屬性的空間分布及其后果卻知之甚少。對生物膜中基因表達(dá)的空間分辨測量顯示，在細(xì)胞長度尺度上存在顯著的生理異質(zhì)性。再者，生物膜內(nèi)部的基質(zhì)成分在細(xì)胞長度尺度上也存在變化。生物膜中的機(jī)械性能很可能在細(xì)胞長度尺度上也有差異，然而在這些微觀尺度上，基質(zhì)成分的空間分布與局部材料屬性之間的關(guān)系仍未可知。 

為探究生物膜內(nèi)部具有空間分辨率的材料特性，此前的研究已在生物膜內(nèi)部置入微觀珠子。珠子的被動擴(kuò)散或在主動擾動后的位移，可用于推斷珠子周邊的機(jī)械環(huán)境。與置于生物膜內(nèi)的微珠不同，細(xì)菌細(xì)胞通過其細(xì)胞表面自身產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多糖，錨定在細(xì)胞外生物膜基質(zhì)上并彼此相連。因此，相較于微珠，細(xì)菌細(xì)胞或許能更***地示蹤生物膜內(nèi)部的局部材料特性?；谶@***理念，我們試圖以細(xì)胞分辨率無創(chuàng)地測量 3D 細(xì)菌生物膜的局部機(jī)械特性。為達(dá)成此目的，我們將高度可重復(fù)的微流控生物膜培養(yǎng)系統(tǒng)與流量控制，同 3D 活細(xì)胞顯微鏡技術(shù)的***新進(jìn)展以及基于深度學(xué)習(xí)的高精度細(xì)胞檢測圖像分析相耦合。

我們的實(shí)驗(yàn)平臺能夠讓我們在各種不同的剪切速率振幅、暴露時長以及生物膜尺寸的廣泛范圍內(nèi)，追蹤霍亂弧菌 3D 生物膜中的單個細(xì)胞在強(qiáng)流體剪切期間及之后的情況。為重構(gòu)生物膜的內(nèi)部材料特性，我們研發(fā)了***種計(jì)算推斷方法，用于從細(xì)胞追蹤數(shù)據(jù)估算彈性力。依據(jù)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞坐標(biāo)變化，我們還能夠以細(xì)胞分辨率量化生物膜內(nèi)部的可塑性，其被定義為生物膜在暴露于流體剪切前后結(jié)構(gòu)上的差異，這可由細(xì)胞位置和方向的改變來確定。我們的測量結(jié)果揭示了生物膜中機(jī)械剛度的空間分布與細(xì)胞外基質(zhì)特定分子成分的空間分布之間存在關(guān)聯(lián)。除了提供細(xì)菌生物膜內(nèi)部局部彈塑性應(yīng)力響應(yīng)的精細(xì)分辨圖像之外，在此開發(fā)的綜合實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法能夠?yàn)榧?xì)胞水平分辨率下生物材料的無創(chuàng)流變學(xué)分析奠定基礎(chǔ)。

為了研究生物膜的機(jī)械性能，我們在微流體通道中培養(yǎng)霍亂弧菌生物膜，從單個細(xì)胞生長到 521 - 9554 個細(xì)胞的群落規(guī)模，其中***大的細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)的生物膜菌落近似半球形，直徑為 50 微米，高度為 17 微米，體積為 5246 微米3。在生物膜培養(yǎng)期間，細(xì)胞在極低的剪切速率（通道底面處的剪切速率為 20.4 秒?1）下持續(xù)暴露于***小 M9 培養(yǎng)基的恒定流動中，這種環(huán)境條件導(dǎo)致生物膜內(nèi)細(xì)胞的中位體積為 0.5 微米3。然后我們停止流動，并進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。我們獲取了生物膜中所有細(xì)胞的三維高分辨率圖像，然后提高微流控通道中的流速，以獲得剪切速率 = 8.16×10^4 s^?1（通道中的平均流速：uaverage = 0.95 m s^?1），然后我們又獲取了另***幅三維圖像。在施加這種強(qiáng)剪切速率特定時間（3 - 40 分鐘）后，我們再次停止流動，并獲取了生物膜的***終三維高分辨率圖像。

圖1，生物膜因剪切流變化引起的變形、恢復(fù)和可塑性。A）在微流控通道中附著于玻璃表面的霍亂弧菌生物膜菌落（5013 個細(xì)胞，V = 3891 μm3）在單細(xì)胞水平上進(jìn)行了 3D 成像，以追蹤強(qiáng)剪切流（剪切速率 8.16 × 10? s?1）作用引起的結(jié)構(gòu)變化。根據(jù)細(xì)胞與 z 軸的角度對細(xì)胞進(jìn)行著色。第***個 3D 圖像時間點(diǎn)稱為“之前”，是在通道中無流動的情況下獲取的。獲取第***個 3D 圖像后，流速從 0 增加到 2000 μL min?1 并保持***定時間（3 - 40 分鐘）。第二個 3D 圖像時間點(diǎn)稱為“變形”，是在強(qiáng)流沿 x 軸施加 1 分鐘時獲取的。第三個 3D 圖像時間點(diǎn)稱為“之后”，是在強(qiáng)流再次停止 1 分鐘后獲取的。在本研究中，我們將前兩個時間點(diǎn)之間的生物膜結(jié)構(gòu)變化稱為“變形”，后兩個時間點(diǎn)之間的稱為“恢復(fù)”，第***個和***后***個時間點(diǎn)之間的稱為“可塑性”。B）基于兩個時間點(diǎn)之間的 3D 擬共形映射，使用細(xì)胞質(zhì)心坐標(biāo)計(jì)算生物膜變形（左）、恢復(fù)（中）和可塑性（右）的應(yīng)變場幅度（I1 = εxx + εyy + εzz）。來自 n = 9 個獨(dú)立重復(fù)生物膜的平均結(jié)果顯示在***個半橢圓形區(qū)域上，為了可視化內(nèi)部，去除了四分之***。C）生物膜變形，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：流體剪切速率從 0 增加到 8.16 × 10? s?1 引起的平均細(xì)胞位移的矢量場。對于 xy 平面矢量場，包括所有 z 坐標(biāo)處的細(xì)胞位移進(jìn)行平均。對于 xz 平面矢量場，包括所有 y 坐標(biāo)處的細(xì)胞位移進(jìn)行平均。D）生物膜恢復(fù)，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：流體剪切速率從 8.16 × 10? 降低到 0 s?1 后平均細(xì)胞位移的矢量場。E）生物膜可塑性，在 xz 平面（上）和 xy 平面（下）可視化：平均細(xì)胞位移的矢量場。在（C - E）中，位移矢量λ的單位在所有圖中是***致的，但按每個圖的插圖所示進(jìn)行了縮放。對于（C - E），使用了來自 n = 87 個獨(dú)立重復(fù)生物膜的數(shù)據(jù)，***先通過將每個生物膜的大小按半徑 R 進(jìn)行歸***化，然后在所有生物膜中對大小為 0.05×R 的空間箱中的細(xì)胞位移進(jìn)行平均。

利用細(xì)菌單細(xì)胞分割以及***個涉及應(yīng)變場計(jì)算的迭代跟蹤算法（圖 1B），該算法是專門為我們實(shí)驗(yàn)生成的圖像數(shù)據(jù)集開發(fā)的（見實(shí)驗(yàn)部分；以及支持信息中的圖 S1），我們在所有三個時間點(diǎn)跟蹤了 274 個獨(dú)立的生物膜中的細(xì)胞?；谶@些細(xì)胞軌跡，我們計(jì)算了在將剪切速率從 0 增加到 8.16×10^4 s^?1 引起的生物膜變形期間（圖 1C），以及在將剪切速率從 8.16×10^4 降低到 0 s^?1 引起的生物膜恢復(fù)期間（圖 1D）的細(xì)胞位移。通過將生物膜恢復(fù)后的細(xì)胞位置與其初始位置進(jìn)行比較，我們能夠研究并量化局部生物膜的可塑性（圖 1E）。在恢復(fù)期間，細(xì)胞位移的大小（但方向相反）與變形期間的細(xì)胞位移相似，導(dǎo)致流量降低后的生物膜形狀看起來與流量增加前的生物膜形狀相似。然而，在變形和恢復(fù)期間，***些***外層的細(xì)胞已被撕裂，并且剩余附著的細(xì)胞存在凈細(xì)胞位移?？傊?，這些結(jié)果表明生物膜表現(xiàn)出較大的彈性響應(yīng)，塑性成分較?。▓D 1C - E）。

Video 1: 在剪切速率從 0 增加到 4.08×10^4 s^-1 ，然后再降低回 0 s^-1 的過程中對霍亂弧菌生物膜變形的可視化。該視頻包含 81 個時間點(diǎn)，在每個時間點(diǎn)，我們獲取了***個 z 間距為 400 納米的完整共聚焦 3D 圖像。在每個成像時間點(diǎn)，剪切速率是恒定的。然而，在每個成像時間點(diǎn)之間，剪切速率會增加或降低：在時間點(diǎn) 1 - 41 之間，剪切速率從 0 以 0.102×10^4 s^-1 的增量增加到 4.08×10^4 s^-1 ；在時間點(diǎn) 41 - 81 之間，剪切速率從 4.08×10^4 以 0.102×10^4 s^-1 的增量降低到 0 s^-1 。為了盡可能減少光暴露和光損傷，我們通過向流入的 M9 培養(yǎng)基中添加***種 DNA 結(jié)合染料（Syto 9 綠色熒光核酸染色劑，5 μmol/l，西格瑪），從細(xì)胞中產(chǎn)生了高熒光信號。在生物膜變形期間的多個時間點(diǎn)獲取 3D 圖像使我們能夠更容易地追蹤細(xì)胞。然而，我們注意到，長時間暴露于 DNA 結(jié)合染料會導(dǎo)致生物膜大幅軟化，這使得該技術(shù)無法常規(guī)用于表征生物膜的機(jī)械性能。

圖2，生物膜的結(jié)構(gòu)在變形、恢復(fù)和可塑性過程中在細(xì)胞層面發(fā)生變化。A）本研究中坐標(biāo)的示意圖：流動沿 x 軸方向；灰色半球表示生物膜形狀；在流動之前、期間和之后的細(xì)胞質(zhì)心 xyz 坐標(biāo)分別描述為 r1、r2 和 r3。B）θz 的定義和沿細(xì)胞主軸的單位向量 n 的示意圖，用于局部向列序參數(shù) Sk 的定義，該參數(shù)是針對所有索引為 l ∈ L 且位于索引為 k 的焦點(diǎn)細(xì)胞表面 1.8 μm 范圍內(nèi)的細(xì)胞計(jì)算的。C）生物膜變形、恢復(fù)、可塑性的側(cè)視圖（xz 平面），針對四個單細(xì)胞層面的結(jié)構(gòu)參數(shù)（Δr，位移；(r × Δr)y，角動量類位移叉積的 y 分量；Δθz，細(xì)胞主軸與 z 軸夾角的變化；ΔS，局部向列序參數(shù)的變化）。D）生物膜變形、恢復(fù)、可塑性的頂視圖（xy 平面），針對四個結(jié)構(gòu)參數(shù)（Δr，r × Δr，Δθz，ΔS）。在（C）和（D）圖中，對 n = 13 個獨(dú)立的生物膜的生物膜結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了測量，這些生物膜體積 V > 2800 μm3，暴露于剪切速率  = 8.16 × 104 s?1 持續(xù) 20 或 40 分鐘。

單細(xì)胞水平生物膜結(jié)構(gòu)參數(shù)的測量結(jié)果表明，在變形和恢復(fù)細(xì)胞位移***大的位置，塑性細(xì)胞位移***大。然而，與變形和恢復(fù)細(xì)胞位移相比，塑性細(xì)胞位移相對較小。相比之下，細(xì)胞取向和向列序參數(shù)的塑性變化與變形和恢復(fù)過程中這些參數(shù)的變化幅度相似。

圖3，相圖展示了***大流速和生物膜體積對生物膜變形、恢復(fù)和可塑性過程中結(jié)構(gòu)變化的影響。A）變形過程中的生物膜結(jié)構(gòu)變化。每個熱圖顯示了***大流速和生物膜體積 V 對生物膜結(jié)構(gòu)參數(shù)（Δr，細(xì)胞位移；|(r×Δr)y|，類似角動量的位移叉積；|Δθz|，細(xì)胞與 z 軸排列的變化；|ΔS|，局部向列序的變化）的影響。熱圖中的每個像素是在此條件下所有生物膜中所有細(xì)胞的平均值。B）恢復(fù)過程中的生物膜結(jié)構(gòu)變化（將剪切速率從***大值降低回 0 s?1 之后）。C）表征可塑性的生物膜結(jié)構(gòu)變化。對于每個熱圖中的每個像素，來自 n≥3 個獨(dú)立復(fù)制生物膜的數(shù)據(jù)取平均值。

為了確定我們系統(tǒng)的哪些特性會影響生物膜結(jié)構(gòu)變化的幅度，我們對不同體積的生物膜、不同的***大剪切速率以及在***大剪切速率下的不同暴露持續(xù)時間進(jìn)行了類似的測量。對于這些實(shí)驗(yàn)中的每***個，我們隨后計(jì)算了 Δr、|(r × Δr)y|、|ΔS| 和 |Δθz|，作為所有重復(fù)生物膜中所有細(xì)胞軌跡的平均值。這些實(shí)驗(yàn)表明，對于生物膜的變形（圖 3A）、恢復(fù)（圖 3B）和可塑性（圖 3C），較大的剪切速率和較大的生物膜體積通常會導(dǎo)致更高的細(xì)胞位移參數(shù)（Δr、|(r × Δr)y|），但 Δr 可塑性除外，其并不強(qiáng)烈依賴于生物膜體積。有趣的是，這些實(shí)驗(yàn)還表明，細(xì)胞取向的***大變化（|ΔS|、|Δθz|）發(fā)生在小體積的生物膜和大剪切速率的情況下（圖 3）。小生物膜表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞取向變化，因?yàn)槠浔砻娣e與體積之比大，并且更大比例的細(xì)胞直接經(jīng)歷流體剪切。然而，體積小的生物膜不會表現(xiàn)出大的細(xì)胞位移，因?yàn)樗鼈兊母叨认鄬^低，細(xì)胞的 z 位置是細(xì)胞位移的關(guān)鍵決定因素（圖 1C - E 和 2C）。對于四個參數(shù)（Δr、|(r × Δr)y|、|ΔS|、|Δθz|）中的每***個，在變形（圖 3A）、恢復(fù)（圖 3B）和可塑性（圖 3C）中，生物膜體積與剪切速率熱圖的模式是相似的。無論生物膜體積如何，***大剪切速率的值是變形、恢復(fù)和可塑性過程中結(jié)構(gòu)變化幅度的關(guān)鍵控制參數(shù)（圖 3）。

生物膜中彈性模量的空間分布
在變形和恢復(fù)過程中，生物膜結(jié)構(gòu)的變化幅度相似但方向相反，這表明生物膜對剪切流的響應(yīng)存在彈性成分（圖 1C - E 和 2C、D）。為了推斷生物膜內(nèi)彈性模量的空間分布，我們將細(xì)胞位移的空間分辨測量結(jié)果與以彈性模量為參數(shù)的生物膜通用力學(xué)模型結(jié)合使用。對于此模型，在施加流動之前，我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定的每個細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)心坐標(biāo)創(chuàng)建了***個 3D 德勞內(nèi)三角剖分，并假設(shè)三角剖分中由邊 e = (i, j) 連接的所有相鄰細(xì)胞質(zhì)心 i 和 j 都通過***個未知剛度 ke 的彈簧連接，彈簧具有靜止長度 （圖 4A，見實(shí)驗(yàn)部分）。在強(qiáng)剪切流期間，生物膜變形，我們使用實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞追蹤數(shù)據(jù)來測量每個彈簧的***終長度 le。系統(tǒng)的彈性能為 ，對于生物膜內(nèi)部坐標(biāo)為 ri 的每個細(xì)胞 i，彈性力平衡，使得 ?H/? ri = 0。重要的是，彈性力僅在生物膜彈性內(nèi)部的細(xì)胞之間平衡，而對于生物膜邊界部分的細(xì)胞不平衡，這些邊界細(xì)胞會受到流體剪切力或細(xì)胞與基底表面的粘附力。為了推斷生物膜內(nèi)部的彈性特性，不需要為生物膜邊界上的細(xì)胞明確建模這些外力。然后，我們針對生物膜中彈性模量 的空間分布求解此模型，僅尋找連續(xù)變化的解（見實(shí)驗(yàn)部分）。我們通過展示該框架能夠基于實(shí)驗(yàn)確定的細(xì)胞質(zhì)心位置準(zhǔn)確恢復(fù)我們在模擬生物膜中指定的彈簧剛度（ke）和模量來證明其穩(wěn)健性。

圖4，生物膜中物質(zhì)特性的空間分布與細(xì)胞外基質(zhì)成分的空間分布相關(guān)。A）用于推斷機(jī)械特性空間分布的模型示意圖：在該模型中，在德勞內(nèi)三角剖分中為相鄰的細(xì)胞質(zhì)心通過未知剛度 k 且靜止長度為 l0 的彈簧連接。然后，我們使用流動前和流動期間細(xì)胞位置的實(shí)驗(yàn)測量值，以及生物膜內(nèi)部細(xì)胞的力平衡條件，來推斷生物膜內(nèi)部相對彈簧模量的空間分布，而沒有明確模擬生物膜邊界部分細(xì)胞的流體 - 細(xì)胞或細(xì)胞 - 基底表面相互作用（見實(shí)驗(yàn)部分）。B）具有歸***化 xy 徑向位置和歸***化 z 位置的彈簧模量 kl0 的空間分布。數(shù)據(jù)是對 n = 10 個獨(dú)立的重復(fù)生物膜進(jìn)行平均。熱圖底部的灰色區(qū)域表示直接附著在基底表面的細(xì)胞（0 ≤ z/Rz ≤ 0.0453）所占據(jù)的區(qū)域，對于該區(qū)域，我們的模型無法提供彈簧模量。C）使用免疫熒光和共聚焦顯微鏡測量的生物膜內(nèi)基質(zhì)蛋白 RbmC 的空間分布。RbmC 的其他數(shù)據(jù)見圖 S11A（支持信息）。數(shù)據(jù)使用與（B）中相同的坐標(biāo)系繪制。D）使用免疫熒光測量的基質(zhì)蛋白 Bap1 的空間分布。Bap1 的其他數(shù)據(jù)見圖 S11B（支持信息）。E）使用免疫熒光測量的基質(zhì)蛋白 RbmA 的空間分布。RbmA 的其他數(shù)據(jù)見圖 S11C（支持信息）。F）使用熒光共軛凝集素測量的基質(zhì)多糖 VPS 的空間分布。正如在圖 S12（支持信息）中 VPS 標(biāo)記的原始圖像所示，即使在沒有細(xì)胞附著的區(qū)域，凝集素也優(yōu)先附著在玻璃表面。來自玻璃表面的這種信號泄漏到生物膜的較高區(qū)域，因此我們無法準(zhǔn)確確定灰色區(qū)域中的 VPS 豐度。每個基質(zhì)成分的數(shù)據(jù)是對≥ 3 個獨(dú)立的重復(fù)生物膜進(jìn)行平均。每個基質(zhì)成分的顏色標(biāo)度是背景扣除后的熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞外基質(zhì)成分的空間分布解釋了彈性模量
我們假設(shè)彈簧模量的空間模式是由自產(chǎn)細(xì)胞外生物膜基質(zhì)成分的變化引起的。為了驗(yàn)證這***點(diǎn)，我們測量了霍亂弧菌生物膜主要基質(zhì)成分的定位和豐度：蛋白質(zhì) RbmA、RbmC、Bap1 和弧菌多糖（VPS）。為了使用共聚焦顯微鏡直接對基質(zhì)成分進(jìn)行成像，我們使用了與熒光染料偶聯(lián)的針對 RbmA、RbmC 和 Bap1 的抗體，以及與熒光染料偶聯(lián)的針對 VPS 的凝集素。

這些實(shí)驗(yàn)表明，對于我們微流體系統(tǒng)中的生物膜，RbmC 在生物膜底部邊緣附近含量豐富（圖 4C），Bap1 位于生物膜底部表面和暴露于流體的外邊緣附近（圖 4D），RbmA 在生物膜面向流體表面的區(qū)域高度豐富（圖 4E）。缺乏 RbmC 或 Bap1 的突變體形成的生物膜對高剪切速率具有顯著的抗性。沒有 RbmA 的生物膜在高剪切速率下很容易從表面剝落，這表明該蛋白質(zhì)對于生物膜的機(jī)械凝聚力很重要，可能是由于其交聯(lián)了長鏈多糖 VPS。然而，基質(zhì)蛋白 RbmC、Bap1 和 RbmA 的空間分布與彈性模量的空間分布沒有定性的相關(guān)性。相比之下，細(xì)胞外基質(zhì)多糖 VPS 顯示出與彈性模量密切相關(guān)的空間分布（圖 4F），這表明 VPS 的豐度是決定生物膜彈性細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用和對剪切流的整體彈性響應(yīng)的關(guān)鍵因素。

通過使 3D 霍亂弧菌生物膜經(jīng)受剪切流的增加和減少，并追蹤由此產(chǎn)生的單個細(xì)胞位移和細(xì)胞重新定向，我們能夠進(jìn)行空間分辨的體內(nèi)流變學(xué)測量。盡管存在強(qiáng)剪切速率（= 8.16 × 104 s?1）和剪切應(yīng)力（τ = 69.7 N / m?2），對應(yīng)于微流體通道中的平均流速 Uaverage = 0.952 m / s?1，但生物膜對剪切流的增加仍然具有顯著的彈性。生物膜內(nèi)的細(xì)胞位移軌跡顯示出彈性響應(yīng)，以及約為彈性響應(yīng) 1/3 大小的塑性響應(yīng)。細(xì)胞定向也顯示出與彈性響應(yīng)大小相似的塑性響應(yīng)。此外，生物膜內(nèi)的彈性和塑性響應(yīng)在空間上是異質(zhì)的。

3D 生物膜內(nèi)彈性響應(yīng)的空間變化使我們推測這些群落內(nèi)部的彈性模量也在空間上發(fā)生變化。通過假設(shè)基于連接相鄰細(xì)胞的彈簧網(wǎng)絡(luò)的生物膜通用力學(xué)模型，我們使用我們的細(xì)胞位移軌跡來獲得生物膜中細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用的彈簧模量的空間分辨圖。彈簧模量的空間分布與連接生物膜局部分子組成與微觀細(xì)胞軌跡和細(xì)胞群落的介觀材料特性的基質(zhì)多糖 VPS 的豐度密切相關(guān)。我們在細(xì)胞尺度上對空間變化的材料特性的觀察補(bǔ)充了以前沒有空間分辨率的生物膜流變學(xué)的宏觀表征。

我們基于結(jié)合實(shí)驗(yàn)細(xì)胞追蹤數(shù)據(jù)和通用彈簧網(wǎng)絡(luò)模型開發(fā)的用于推斷細(xì)菌生物膜體內(nèi)內(nèi)部彈性特性的方法，可用于推斷任何可以進(jìn)行細(xì)胞分辨率成像的不均勻彈性生物材料的內(nèi)部特性。由于 3D 活細(xì)胞顯微鏡技術(shù)的***新改進(jìn)和基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的圖像分析能夠?yàn)樵S多其他生物系統(tǒng)獲得單細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)，我們預(yù)計(jì)我們的推斷框架將廣泛適用于細(xì)胞尺度上生物材料的體內(nèi)流變學(xué)分析。

在生長過程中，生物組織和微生物群落消耗營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生廢物，這建立了資源梯度和局部變化的微環(huán)境，***終導(dǎo)致局部變化的基因表達(dá)和局部變化的基質(zhì)成分產(chǎn)生。由于這些資源梯度預(yù)計(jì)不會隨時間保持恒定，我們預(yù)計(jì)生物膜的材料特性不僅如本研究所示在空間上是異質(zhì)的，而且在時間上也是異質(zhì)的。生物膜的時空材料特性的全譜尚未得到表征，這可能為通過機(jī)械剪切去除生物膜以及設(shè)計(jì)具有可調(diào)剪切響應(yīng)的生物材料揭示機(jī)會窗口。

Video 2: 使用 0.1 微米的熒光示蹤珠，對微流控通道中霍亂弧菌生物膜菌落周圍的流動情況進(jìn)行了可視化展示。視頻中的不同畫面幀對應(yīng)著通道中不同的 z 高度（z 位置在左上角標(biāo)明）。對于通道中的每個特定 z 位置，視頻的每個畫面幀都展示了示蹤珠的原始熒光圖像（左）、帶有疊加流場矢量的生物膜原始熒光圖像（中）以及生物膜周圍的流速（右）。

細(xì)菌培養(yǎng)與生物膜生長

本研究中使用的主要菌株源自霍亂弧菌 N16961 野生型，通過引入賦予粗糙度的 vpvCW240R 等位基因，并引入導(dǎo)致直桿狀細(xì)胞形狀的?crvA（VCA1075）突變。該菌株還含有***個質(zhì)粒（pNUT542），該質(zhì)粒帶有慶大霉素抗性和***個無 lacO 的 Ptac 啟動子，以驅(qū)動 sfGFP 的組成型產(chǎn)生。所得的細(xì)菌菌株稱為 KDV613，[52]并用于本研究中的所有剪切流變形實(shí)驗(yàn)。本研究中使用的其他菌株均為 KDV613 的衍生物，但 KDV2013 除外，它含有不同的質(zhì)粒?；魜y弧菌生物膜在 M9 基本培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有 2 mM MgSO4、100 μm CaCl2、MEM 維生素（Sigma）、0.5% w/v 葡萄糖和 15 mM 三乙醇胺（pH 7.1）。LB 培養(yǎng)基用于過夜培養(yǎng)，包含 10 g L?1 胰蛋白胨、5 g L?1 酵母提取物和 10 g L?1 NaCl。此外，向 LB 和 M9 培養(yǎng)基中加入 30 μg mL?1 慶大霉素，以維持質(zhì)粒 pNUT542。

產(chǎn)生 sfGFP 的霍亂弧菌生物膜在微流控流動室（室尺寸：[寬度；高度；長度] = [500；70；7000] μm）中生長。流動室由通過氧等離子體與玻璃蓋玻片結(jié)合的聚二甲基硅氧烷構(gòu)建而成。微流控設(shè)計(jì)在每個蓋玻片上包括四個獨(dú)立的通道。這些微流控通道的制造過程保證了高度可重復(fù)的通道尺寸和表面特性。每個通道都接種了霍亂弧菌菌株的培養(yǎng)物，培養(yǎng)物的制備如下：在液體 LB 培養(yǎng)基中于 28°C 振蕩條件下過夜培養(yǎng)，早晨在 LB 培養(yǎng)基中以 1:200 回稀釋，并培養(yǎng)至 600 nm 處的光密度為 0.5。該培養(yǎng)物用于接種流動通道。通道接種后，1 小時內(nèi)不啟動流動，以允許細(xì)胞牢固地附著在表面。然后，以 100 μL / min?1 的流速將液體 M9 培養(yǎng)基通過通道推送 45 秒，以洗去非粘附細(xì)胞并從通道中去除 LB 生長培養(yǎng)基。然后將通過通道的流速設(shè)置為 0.5 μL / min?1，以連續(xù)向通道供應(yīng)新鮮的 M9 培養(yǎng)基，使表面粘附的單細(xì)胞生長為生物膜。通道接種后的流速和生物膜生長期間的流速使用高精度注射泵控制。

不同流體剪切力的實(shí)驗(yàn)
霍亂弧菌生物膜在微流體流動室中培養(yǎng)，存在低流速（0.5 μL min?1，20.4 s?1），該流速由注射泵控制。在生物膜高度 Rz 達(dá)到約 10 - 30 μm 后，將注射泵與流動室的入口斷開，并由微流體壓力控制器（OB1 MK3+，Elveflow）取代。該壓力控制器通過整合來自流量傳感器（MFS5，Elveflow）的反饋，能夠向微通道施加更高且更穩(wěn)定的流速。流速、顯微鏡載物臺和 3D 共聚焦成像通過使用 MATLAB 控制 μManager[63]和流量控制軟件（ESI，Elveflow）同時進(jìn)行控制。為了在強(qiáng)流實(shí)驗(yàn)期間抑制蛋白質(zhì)產(chǎn)生和細(xì)胞分裂，在 M9 培養(yǎng)基中加入兩種抗生素（10 μg mL?1 甲氧芐啶，3 μg mL?1 四環(huán)素），并在開始成像和改變流速之前讓其在通道中流動 10 分鐘。強(qiáng)流以階躍函數(shù)的形式施加：從 0 μL min?1 開始，然后變?yōu)槟繕?biāo)強(qiáng)流速，然后再次設(shè)置為 0 μL min?1。由于壓力控制器對流速加速的限制，從 0 增加到 2000 μL min?1 并使微流體通道中的流速穩(wěn)定下來需要 15 秒，這是該系統(tǒng)中可達(dá)到的***大幅度。同樣，將流速從 2000 μL min?1 降低并穩(wěn)定回 0 μL min?1 也需要 15 秒。在 3 個時間點(diǎn)對 3D 生物膜體積進(jìn)行成像：施加強(qiáng)流之前、強(qiáng)流期間（流速增加 1 分鐘后）和流速降低 1 分鐘后（圖 1A）。作為實(shí)驗(yàn)參數(shù)，生物膜暴露于不同的***大流速（100、200、500、1000、2000 μL min?1），或者使用不同體積 V 的生物膜（519 μm3 < V < 6032 μm3），或者改變高流速的持續(xù)時間（3、5、10、20、40 分鐘）。每個生物膜變形測量都是在不同的微流體通道中對之前未暴露的生物膜進(jìn)行的。

(文章來源于儀器網(wǎng))