顯微鏡的產(chǎn)生和發(fā)展對(duì)于生命科學(xué)研究的進(jìn)步有至關(guān)重要的作用，它將微觀世界呈現(xiàn)在大***面前，包括微生物的存在、組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生理病理活動(dòng)等。顯微鏡技術(shù)的不斷革新將成像分辨率不斷提高，但相當(dāng)長(zhǎng)***段時(shí)間內(nèi)光學(xué)成像無法突破***個(gè)極限值，即xy軸橫向分辨率約200nm，z軸縱向分辨率約500nm，因此小于這個(gè)尺寸的生命活動(dòng)和結(jié)構(gòu)，如病毒、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等無法清楚地觀察到。

聚焦點(diǎn)的光強(qiáng)會(huì)根據(jù)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（point spread function，PSF）而展開，對(duì)于圓形孔徑，PSF呈現(xiàn)為艾里斑（Airy disk）的模式。激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的分辨率取決于PSF的大小，如果焦點(diǎn)很小，則每個(gè)像素點(diǎn)獲取到的信息也很小，從而得到清晰銳利的圖像；反之，則結(jié)果圖像變得模糊。因此，CLSM成像的主要挑戰(zhàn)在于實(shí)現(xiàn)越來越小的PSF以獲得更好的分辨率。德***物理學(xué)***恩斯特·阿貝（Ernst Abbe，1840-1905年）在19世紀(jì)70年代***次提出阿貝衍射極限，即由于衍射效應(yīng)，PSF大小與λ/NA成正比（d=0.61λ/NA），其中λ是光的波長(zhǎng)，NA是物鏡***重要的參數(shù)——數(shù)值孔徑。由于可見光波長(zhǎng)范圍在400-760nm之間，NA值***大在1.7左右，所以分辨率極限在200nm左右。隨著物理學(xué)和測(cè)量技術(shù)的進(jìn)步，突破衍射極限的顯微鏡不斷涌現(xiàn)，公認(rèn)的超高分辨顯微鏡主要有三類，包括結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（Structured Illumination Microscopy，SIM），受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），和單分子定位顯微鏡（SMLM）。單分子定位顯微鏡包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。2014年三位科學(xué)***史蒂芬·霍爾（Stefan W. Hell）、埃里克·貝茲（Eric Betzig）和威廉·莫納（William E. Moerner）因他們?cè)诔叻直骘@微鏡技術(shù)領(lǐng)域的貢獻(xiàn)而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)然，新興***低光子數(shù)顯微成像（MINimal Photon FLUXes，MINFLUX）作為第四類超高分辨顯微鏡，也被更多的學(xué)者了解和關(guān)注。

超高分辨顯微鏡成像既利用了光學(xué)顯微成像原有的無損性質(zhì)（與電鏡高分辨成像相比），又可以很好地突破普通顯微鏡中衍射極限對(duì)成像分辨率的限制，因此其發(fā)明和發(fā)展對(duì)于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究具有非常重要的意義。不同類型的超高分辨顯微鏡自問世后均被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中，包括生命體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的探索以及疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制等。不過，不同類型的超高分辨顯微鏡由于空間分辨率、時(shí)間分辨率、光漂白和光損傷等諸多問題，實(shí)際應(yīng)用中各有利弊。雖然成像技術(shù)發(fā)展很快，但技術(shù)限制依舊存在，如何獲得更高的空間分辨率、更深的成像深度和更快的時(shí)間分辨率以滿足更精確更快生物過程的研究依舊任重道遠(yuǎn)。

SIM技術(shù)的前身可以追溯到20世紀(jì)70年代初。當(dāng)時(shí)，光學(xué)學(xué)***特奧多爾·赫普恩（Theodor H?upl）***次提出了使用周期性光柵照明來提高顯微鏡分辨率的想法。這奠定了SIM技術(shù)的基礎(chǔ)，盡管當(dāng)時(shí)還沒有實(shí)體的SIM顯微鏡。21世紀(jì)初期，SIM技術(shù)開始廣泛傳播，吸引了生物學(xué)***和顯微鏡專***的關(guān)注，它是***種相對(duì)低成本的超高分辨率成像方法，因?yàn)樗恍枰嘿F的激光設(shè)備或復(fù)雜的樣品準(zhǔn)備。

SIM本質(zhì)是激發(fā)光透過可橫向移動(dòng)的光柵產(chǎn)生正弦條紋圖案照射樣品，正弦條紋照明圖案與樣品本身的信息疊加形成莫爾條紋，將樣品結(jié)構(gòu)中的高空間頻率信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭赏ㄟ^物鏡收集的較低空間頻率信息，***后通過后期數(shù)據(jù)處理得到樣品的高分辨圖像。SIM的單幅原始圖像的采集速度只取決于樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度和探測(cè)器的采集速度，通常只需要采集9幀原始圖像，與基于點(diǎn)掃描成像的STED和需要采集幾萬幀原始圖像的SMLM相比，要快得多，基本可以達(dá)到實(shí)時(shí)觀察。但SIM受其成像原理的制約，***多只能將橫向分辨率提升為傳統(tǒng)顯微鏡的2倍（即100 nm左右），因此分辨率遠(yuǎn)不及其他超高分辨顯微鏡技術(shù)。但SIM對(duì)熒光探針沒有光開關(guān)或抗淬滅的特殊需求，其***大的優(yōu)勢(shì)也是寬場(chǎng)成像速度快，所以更多更廣泛地應(yīng)用在活細(xì)胞成像領(lǐng)域。

單分子定位顯微鏡中熒光標(biāo)記的單個(gè)分子被分別激發(fā)和檢測(cè)，可以極高的精度確定單分子的中心從而實(shí)現(xiàn)高分辨率，包括光敏定位顯微鏡（Photoactivation Localization Microscopy，PALM）和隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）。

PALM的歷史可以追溯到2006年，由埃里克·貝茲（Eric Betzig）和哈拉爾德·赫斯（Harald Hess）提出了單分子定位這***概念。同期STORM的成像技術(shù)也發(fā)展起來，代表是華人科學(xué)***莊小威。STORM和PALM工作原理類似，都是通過特殊的分子標(biāo)記和隨機(jī)活性化，實(shí)現(xiàn)單分子定位進(jìn)而實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像。在SMLM成像中，光開關(guān)熒光蛋白（PALM）或閃爍染料（STORM）扮演著重要角色，它們?cè)凇伴_態(tài)”和“關(guān)態(tài)”間可以相互轉(zhuǎn)換，處于開態(tài)時(shí)可被激發(fā)產(chǎn)生熒光，而處于關(guān)態(tài)時(shí)不發(fā)射熒光。在每***個(gè)成像周期內(nèi)隨機(jī)只讓***小部分熒光團(tuán)打開，其余熒光團(tuán)暫時(shí)關(guān)閉，這樣每***幅圖像中熒光團(tuán)的光斑不會(huì)重疊，可以高精度地定位出每個(gè)熒光團(tuán)的位置。重復(fù)這個(gè)過程，使每個(gè)周期內(nèi)都隨機(jī)打開***部分熒光團(tuán)，這樣可以在不同時(shí)間點(diǎn)捕獲標(biāo)記物的位置，通過記錄標(biāo)記物的位置可以得到它們的坐標(biāo)，獲得足夠多的數(shù)據(jù)點(diǎn)可將所有的定位信息疊加起來，就能重構(gòu)出***幅超分辨圖像。這種以成像時(shí)間換取空間分辨率的形式，使得PALM或STORM的分辨率通常能夠達(dá)到數(shù)十納米。

德***科學(xué)***Stefan W. Hell于1994年***次理論上提出STED顯微鏡的概念，并在2000年進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。STED超高分辨技術(shù)的基礎(chǔ)原理是利用受激發(fā)射效應(yīng)減小有效熒光發(fā)光面積，即在STED顯微成像中，通過使用***個(gè)激發(fā)光束和***個(gè)環(huán)形的耗損光束，使得熒光分子的激發(fā)區(qū)域比阿貝衍射極限更小。耗損光束通過受激發(fā)射將外圍的熒光分子去激發(fā)，只留下中心區(qū)域的熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)納米***別的分辨率。我們也叫它“甜甜圈”技術(shù)。STED成像技術(shù)可以通過非線性效應(yīng)提高分辨率，即其分辨率與STED“甜甜圈”損耗光強(qiáng)有關(guān)，提高“甜甜圈”光的強(qiáng)度可以使熒光光斑焦點(diǎn)中心直徑縮小，但是實(shí)際應(yīng)用中，光損傷較大，“甜甜圈”光強(qiáng)不可能無限增加，顧其分辨率***高可達(dá)到30nm左右。此外，STED成像技術(shù)還包括對(duì)光束進(jìn)行精確調(diào)制、校準(zhǔn)和掃描，以及采用高性能探測(cè)器進(jìn)行成像，加之其“甜甜圈”光毒性、光淬滅等問題比較明顯，STED技術(shù)對(duì)熒光染料和封片劑的抗淬滅要求較高。

近年來，得益于新的硬件革新及技術(shù)手段的引入、熒光染料和探針的改進(jìn)、光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)化和更精確的成像算法等，STED技術(shù)在分辨率和應(yīng)用方面都有了顯著提升，發(fā)展為易用、穩(wěn)定的成熟商業(yè)產(chǎn)品，逐步成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的研究工具。STED技術(shù)結(jié)合熒光壽命成像更是發(fā)揮了降低損耗光強(qiáng)度優(yōu)勢(shì)、打破相近波長(zhǎng)染料不可共染的限制，進(jìn)***步降低了光漂白、提高了分辨率。